2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cells,NK cells),作為與T細(xì)胞、B細(xì)胞并列的一大類淋巴細(xì)胞群體,是天然免疫系統(tǒng)的重要成員。NK細(xì)胞除了參與先天性免疫應(yīng)答之外,還在適應(yīng)性免疫的免疫調(diào)節(jié)中起著重要的調(diào)控作用。研究表明,NK細(xì)胞在病原微生物感染、腫瘤以及自身免疫病等多種病理過程中都發(fā)揮著重要的功能。然而,NK細(xì)胞的發(fā)育、分化以及功能的調(diào)節(jié)等研究領(lǐng)域還存在許多空白。因此,深入研究NK細(xì)胞發(fā)育及其功能的調(diào)控機(jī)制將具有重要

2、的意義。
   胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1),其生物學(xué)功能非常廣泛,已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道IGF-1可以促進(jìn)T、B細(xì)胞的發(fā)育和生物學(xué)功能;但I(xiàn)GF-1在NK細(xì)胞發(fā)育及功能中有何作用卻鮮有報(bào)道。本課題主要研究IGF-1在人NK細(xì)胞發(fā)育及功能中的調(diào)控作用,并深入探討其機(jī)制,進(jìn)一步完善人NK細(xì)胞的基礎(chǔ)生物學(xué)理論,并為NK細(xì)胞的臨床生物治療提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
   本課題

3、首先分離正常的新生兒臍帶血來源的CD34+造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells,HSC),加入干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)、Flt3配體(fms-like tyrosine kinase-3 ligand,F(xiàn)lt3L)和白介素-15(interleukin-15,IL-15)進(jìn)行長期培養(yǎng)(28天),進(jìn)行體外NK細(xì)胞的分化及擴(kuò)增,通過在該體系中加入IGF-1,探討IGF-1對人NK細(xì)胞的發(fā)

4、育及功能的影響及相關(guān)分子機(jī)制;其次分離正常人早孕蛻膜NK細(xì)胞,體外用IGF-1刺激,進(jìn)一步闡明IGF-1對人NK細(xì)胞功能的影響及分子機(jī)制;此外,我們在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同來源的NK細(xì)胞分泌不同水平的IGF-1,因此,利用IGF-1 siRNA及中和抗體阻斷實(shí)驗(yàn)闡明內(nèi)源性IGF-1對NK細(xì)胞功能的影響;為了揭示不同來源NK細(xì)胞差異表達(dá)內(nèi)源性IGF-1的分子機(jī)制,我們利用microRNA芯片技術(shù)比較不同來源的NK細(xì)胞micmRNA表達(dá)譜差異,以篩

5、選調(diào)控NK細(xì)胞內(nèi)源性IGF-1表達(dá)的microRNA,并驗(yàn)證目的microRNA通過靶向IGF-1調(diào)控NK細(xì)胞的功能。
   一、 IGF-1促進(jìn)人NK細(xì)胞發(fā)育。
   我們應(yīng)用體外人NK細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系,即體外分離純化新生兒臍帶血來源的CD34+造血干細(xì)胞,采用SCF、Flt3L、IL-15聯(lián)合細(xì)胞因子刺激CD34+HSC分化發(fā)育為NK細(xì)胞。通過在該體系中加入IGF-1,培養(yǎng)28天后收集細(xì)胞,計(jì)數(shù),進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)

6、檢測CD3℃D56+NK細(xì)胞的比例、表面受體分子的表達(dá)及其功能性指標(biāo)的表達(dá)變化,明確IGF-1在人NK細(xì)胞的發(fā)育及功能中的作用;通過檢測NK細(xì)胞發(fā)育過程中IRS-1的表達(dá)水平,初步闡明IGF-1促進(jìn)NK細(xì)胞發(fā)育的機(jī)制。
   結(jié)果顯示,當(dāng)在該體系中加入IGF-1后,NK細(xì)胞的比例和絕對數(shù)都有顯著提高;流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入IGF-1組發(fā)育分化的NK細(xì)胞殺傷相關(guān)分子如穿孔素的表達(dá)上調(diào),脫顆粒的能力上調(diào)(CD107a表達(dá)上調(diào))。

7、
   此外,我們發(fā)現(xiàn)在體外NK細(xì)胞發(fā)育過程的第14天,即NK細(xì)胞前體出現(xiàn)的時(shí)間,細(xì)胞不表達(dá)IRS-1,而在發(fā)育過程的第21天,細(xì)胞則表達(dá)IRS-1。鑒于IRS-1在IGF-1信號傳遞中的作用,我們得出以下結(jié)論:在IGF-1促進(jìn)NK細(xì)胞發(fā)育的過程中,IGF-1可能起雙重作用,即IGF-1先促進(jìn)NK細(xì)胞前體的分化,之后則促進(jìn)分化后NK細(xì)胞的增殖。
   綜上結(jié)果,我們得出如下結(jié)論:IGF-1可以促進(jìn)人NK細(xì)胞發(fā)育,且有可能

8、提高NK細(xì)胞的殺傷潛能。
   二、 IGF-1促進(jìn)入NK細(xì)胞殺傷功能。
   為了進(jìn)一步驗(yàn)證IGF-1對人NK細(xì)胞殺傷功能的影響,我們首先收集正常人早孕蛻膜組織,分離純化蛻膜NK細(xì)胞,體外用IGF-1刺激培養(yǎng)24 h,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測NK細(xì)胞穿孔素perforin及CD107a的表達(dá);51Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(殺傷功能)的變化。同時(shí),我們對IGF-1刺激NK細(xì)胞后胞內(nèi)信號分子進(jìn)行了初步檢測,以進(jìn)一步闡

9、明IGF-1促進(jìn)人NK細(xì)胞殺傷功能的相關(guān)分子機(jī)制。
   流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,當(dāng)IGF-1刺激早孕蛻膜NK細(xì)胞后,NK細(xì)胞perforin及CD107a表達(dá)均顯著上調(diào),51Cr釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,IGF-1刺激蛻膜NK細(xì)胞后其細(xì)胞毒活性(殺傷功能)也有顯著提高。
   此外,我們發(fā)現(xiàn)IGF-1可以促進(jìn)NK細(xì)胞中STAT3的磷酸化,而且STAT3的抑制劑在抑制STAT3活化的同時(shí),也抑制了NK細(xì)胞perforin的表達(dá),

10、這表明IGF-1促進(jìn)NK細(xì)胞殺傷功能的機(jī)制,可能是通過STAT3信號途徑啟動(dòng)了perforin的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮其更強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。
   根據(jù)這部分結(jié)果我們得出如下結(jié)論:IGF-1可以促進(jìn)人NK細(xì)胞的殺傷功能。
   三、內(nèi)源性IGF-1對NK細(xì)胞的殺傷功能至關(guān)重要。
   在實(shí)驗(yàn)過程中,我們發(fā)現(xiàn)不同來源的NK細(xì)胞,如正常人外周血NK(pNK)細(xì)胞及早孕蛻膜組織中的NK(dNK)細(xì)胞均可分泌IGF-1,且分泌水平

11、存在差異。鑒于不同來源的NK細(xì)胞其殺傷功能存在差異,因此我們推測內(nèi)源性IGF-1可能參與NK細(xì)胞殺傷功能的調(diào)控。為了進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)源性IGF-1在人NK細(xì)胞殺傷功能中的重要調(diào)控作用,我們利用核轉(zhuǎn)染技術(shù)將IGF-1 siRNA轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞系,qRT-PCR檢測perforin等殺傷相關(guān)基因的表達(dá)變化;利用IGF-1中和抗體處理人外周血NK細(xì)胞,51Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測NK細(xì)胞殺傷功能的變化。
   結(jié)果顯示,當(dāng)IGF-1 siRNA轉(zhuǎn)染

12、NK細(xì)胞系后,NK細(xì)胞perforin表達(dá)下調(diào);51Cr釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:當(dāng)IGF-1中和抗體處理外周血NK細(xì)胞后,NK細(xì)胞的殺傷功能顯著降低。此外,我們發(fā)現(xiàn)臨床上反復(fù)流產(chǎn)病人的早孕蛻膜NK(dNK)細(xì)胞較正常人早孕蛻膜NK(dNK)細(xì)胞表達(dá)較高的內(nèi)源性IGF-1,這與它們的殺傷能力呈正相關(guān)趨勢。
   綜上結(jié)果我們得出如下結(jié)論:內(nèi)源性IGF-1對NK細(xì)胞的殺傷功能至關(guān)重要。
   四、 miR-483-3p靶向IGF-

13、1調(diào)控人NK細(xì)胞的殺傷功能。
   為了揭示不同來源NK細(xì)胞差異表達(dá)內(nèi)源性IGF-1的分子機(jī)制,我們采用microRNA芯片技術(shù),比較不同來源的NK細(xì)胞(dNK,cNK,pNK)以及外周血來源的NKT和T細(xì)胞之間microRNA的表達(dá)譜差異;利用靶基因預(yù)測網(wǎng)站分析與IGF-1相互作用的microRNA;利用分子克隆方法構(gòu)建IGF-13UTR雙熒光素酶報(bào)告載體并鑒定,之后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測方法驗(yàn)證microRNA與靶基因相

14、互作用;利用microRNA模擬體mimic和抑制劑inhibitor,并結(jié)合IGF-1中和抗體闡明microRNA通過靶向IGF-1調(diào)控人NK細(xì)胞的殺傷功能。
   microRNA芯片檢測結(jié)果顯示,不同來源的人NK細(xì)胞其microRNA表達(dá)譜有著顯著的差異;此外我們篩選到7個(gè)在NK細(xì)胞中特異表達(dá)的microRNAs:miR-340*,miR-483-3p,miR-130a, miR-199b-5p,miR-199a-3p,m

15、iR-210和miR-362-5p。其中miR-483-3p在早孕蛻膜NK(decidual NK,dNK)細(xì)胞中特異性高表達(dá),利用Targetscan等預(yù)測網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)IGF-1為其潛在相互作用的靶基因;接下來,我們成功構(gòu)建了分別包含IGF-1野生型3'UTR及突變型3'UTR的雙熒光素酶報(bào)告基因載體,并采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn),驗(yàn)證miR-483-3p可與預(yù)測靶基因IGF-1相互作用。我們迸一步采用miR-483-3p mimic

16、核轉(zhuǎn)染NK細(xì)胞,上調(diào)NK細(xì)胞中miR-483-3p的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞殺傷能力減弱;相反,用miR-483-3p inhibitor核轉(zhuǎn)染dNK細(xì)胞,下調(diào)dNK細(xì)胞中hsa-miR-483-3p的表達(dá)后,結(jié)果發(fā)現(xiàn)dNK細(xì)胞殺傷能力顯著增強(qiáng),并且IGF-1中和抗體可以逆轉(zhuǎn)miR-483-3p inhibitor對NK殺傷功能的影響。這表明miR-483-3p通過直接靶向NK細(xì)胞內(nèi)源性IGF-1的表達(dá),進(jìn)而抑制NK細(xì)胞的殺傷功能。

17、>   綜合以上,本課題的研究發(fā)現(xiàn)了生長因子IGF-1在人NK細(xì)胞中的新功能,即IGF-1可以促進(jìn)人NK細(xì)胞的發(fā)育和細(xì)胞毒活性(殺傷功能),并深入闡述了其中的詳細(xì)機(jī)制。此外,我們發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞的內(nèi)源性IGF-1的表達(dá)對NK細(xì)胞的殺傷功能至關(guān)重要;不同來源的NK細(xì)胞殺傷功能的差異可能來自于其內(nèi)源性IGF-1的差異表達(dá),NK細(xì)胞IGF-1的差異表達(dá)受miR-483-3p的調(diào)控,即miR-483-3p可以通過靶向IGF-1調(diào)控NK細(xì)胞的殺傷功

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