

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、一、前言
自然殺傷細胞(natural killer cell,NK cell)是固有免疫系統(tǒng)的重要組分,其通過釋放胞毒效應分子(穿孔素、顆粒酶等)而殺傷畸變的自身細胞及感染病原體的靶細胞。NK細胞無需致敏即能直接殺傷靶細胞,并可連續(xù)殺傷多個靶細胞。
目前尚不清楚,NK細胞每次殺傷過程中所釋放胞毒效應分子的量,及其連續(xù)殺傷過程中通過何種機制不斷補充自身“彈藥庫”以維持“戰(zhàn)斗力”。理論上,NK細胞可不斷合成新的
2、效應分子,但該過程涉及效應分子的糖基化修飾、剪切、構象改變,最后進入分泌性溶酶體,全程需數(shù)小時。因此,探討NK細胞持續(xù)性殺傷過程中合成和儲備胞毒效應分子的確切機制,有助于從新的角度闡明NK細胞殺傷功能的機制。
免疫突觸與神經(jīng)突觸有諸多相似之處。文獻報道,神經(jīng)突觸胞吐后可發(fā)生有效的補償性內吞,此對于維持突觸功能具有重要意義。神經(jīng)突觸內分泌性囊泡與細胞膜融合后,包括膜蛋白的多種分子可迅速回收至神經(jīng)細胞內,其生物學意義為:減少胞
3、吐所致細胞膜表面積增大;回收的膜蛋白可參與形成新的分泌囊泡,從而有利于神經(jīng)突觸適應不斷發(fā)放的神經(jīng)沖動。除膜蛋白外,神經(jīng)細胞還可回收可溶性神經(jīng)遞質。近年文獻(包括本課題組前期研究)報道,免疫突觸中存在雙向運輸?shù)妮d體,也具有回收存儲胞毒效應分子的分泌性溶酶體膜蛋白的能力。深入探討胞毒效應分子的回收作用,有助于揭示細胞毒性T細胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL)和NK細胞持續(xù)性殺傷作用的機制。穿孔素是一類重要的胞毒效應分子
4、,在NK細胞殺傷靶細胞過程中發(fā)揮重要作用,本文擬在課題組前期研究基礎上,探討NK細胞回收穿孔素的作用,并闡明其機制及生物學意義。
二、NK92細胞受靶細胞刺激后可繼發(fā)性內吞釋放的穿孔素
早期內體是細胞回收細胞外物質的最初細胞器,早期內體體積增大提示外源性物質的進入。本實驗用熒光標記的轉鐵蛋白作為示蹤分子,觀察其被NK92細胞內吞后的定位。轉鐵蛋白內吞后進入早期內體,導致后者體積顯著增大,可作為細胞發(fā)生內吞的指
5、標。此外,與早期內體共定位也表明內吞的分子已進入早期內體。
通過觀察NK92細胞早期內體,判斷NK92細胞被靶細胞刺激后是否發(fā)生胞吞,結果發(fā)現(xiàn):NK92細胞受靶細胞刺激15分鐘后,其早期內體比對照組明顯增大,提示NK92細胞發(fā)生內吞。
乙二醇四醋酸[Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraaceticacid,EGTA]可抑制NK92細胞胞吐
6、,但并不影響NK92細胞與靶細胞間形成免疫突觸。為探討內吞發(fā)生的時相,我們在NK92細胞與靶細胞接觸過程中加入EGTA,發(fā)現(xiàn)可顯著抑制早期內體增大。提示NK細胞內吞繼發(fā)性于胞吐之后。
我們還發(fā)現(xiàn),靶細胞刺激NK92細胞15分鐘,穿孔素與早期內體出現(xiàn)明顯共定位現(xiàn)象,而未受刺激的NK92細胞無此現(xiàn)象。另外,加入EGTA 同樣可抑制穿孔素與早期內體共定位。上述結果表明,NK92細胞殺傷靶細胞過程中出現(xiàn)穿孔素內吞,該效應繼發(fā)于胞吐
7、。
三、NK92細胞通過clathrin 途徑回收穿孔素
首先應用放線菌酮抑制新蛋白質合成,以避免新生成的穿孔素干擾實驗結果。繼而應用針對不同胞吞途徑的抑制劑,探討NK92細胞內吞作用的機制。結果發(fā)現(xiàn):應用針對clathrin 途徑的抑制劑后,受靶細胞刺激的NK92細胞內其穿孔素水平明顯降低(與未用抑制劑的NK92細胞相比);應用針對脂筏和胞飲途徑的抑制劑并不影響胞內穿孔素水平。提示:穿孔素內吞效應為clat
8、hrin 途徑依賴性,脂筏和胞飲途徑介導的內吞不參與穿孔素回收。
借助共聚焦顯微鏡進一步證實穿孔素循clathrin 內吞途徑被回收,結果發(fā)現(xiàn):
在針對clathrin 內吞途徑的化學抑制劑作用下,NK92細胞受靶細胞刺激后,穿孔素和早期內體無共定位。另外,應用更具特異性的小干擾RNA(small interferingRNA,siRNA)證實穿孔素回收途徑:用針對clathrin 重鏈(clathrin h
9、eavy chain,CHC)的siRNA 干擾NK92細胞clathrin表達,48 小時后,靶細胞刺激并不導致穿孔素和早期內體共定位;而用針對無關序列的siRNA 干擾NK92細胞48 小時,受靶細胞刺激后,穿孔素和早期內體出現(xiàn)明顯共定位。由此證實,穿孔素可以由clathrin 內吞途徑介導進入早期內體。
四、抑制穿孔素回收可影響NK92細胞殺傷功能
用針對clathrin 內吞途徑的抑制劑阻斷穿孔素回收
10、,檢測對NK92細胞殺傷靶細胞功能的影響:效應細胞與靶細胞比例為5:1和10:1,檢測NK92細胞對原代豬內皮細胞(Primary porcine endothelial cells,PEC)和人紅白血病細胞株(Humanerythroleukemia cell line,K562)的殺傷率;應用clathrin 內吞途徑抑制劑,NK92細胞對靶細胞殺傷率明顯低于對照組;用針對CHC的siRNA 干擾NK92細胞(48h),導致后者對靶
11、細胞殺傷率明顯降低(用針對無關序列的siRNA 干擾作為對照)。
為探討clathrin 途徑依賴的胞吞在NK92細胞持續(xù)性殺傷靶細胞中的作用,將效應細胞與靶細胞比例設為1:2和1:5,檢測不同時間點NK92細胞對靶細胞(PEC和K562)的殺傷率。與上述結果相印證,在效靶細胞比例倒置的情況下,NK92細胞對靶細胞的殺傷率隨殺傷時間延長而逐步增高;抑制clathrin 途徑的內吞(化學抑制劑和siRNA)后,NK92細胞對
12、靶細胞的殺傷率低于對照(未抑制clathrin 途徑)。
五、人外周血NK細胞也能夠回收釋放的穿孔素
為觀察原代NK細胞是否也存在類似現(xiàn)象,用磁珠分離新鮮人外周血NK細胞(純度>95%),用靶細胞刺激NK細胞15分鐘,穿孔素與早期內體出現(xiàn)明顯共定位現(xiàn)象,而靜息狀態(tài)下不發(fā)生此現(xiàn)象。同時,抑制clathrin 介導的內吞途徑,則NK細胞的殺傷功能降低。
上述結果表明,clathrin 途徑介導的內吞
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- SLE患者外周血淋巴細胞穿孔素表達及糖皮質激素對穿孔素的影響.pdf
- 噬血細胞綜合征穿孔素基因和穿孔素及顆粒酶B表達.pdf
- 顆粒溶素與穿孔素的表達及其對肺癌細胞影響的研究.pdf
- 重試子癇前期患者母胎界面中CD56+NK細胞及穿孔素蛋白的表達.pdf
- 慢性HBV感染者外周血HBV特異性CTL、NK細胞、NKT細胞穿孔素表達.pdf
- 血小板對NK細胞殺傷作用的影響.pdf
- IL-2-IL-15刺激前后臍血與骨髓自然殺傷細胞的穿孔素表達及細胞毒活性.pdf
- 跨膜型TNF-α介導的反向信號對NK細胞殺傷功能的影響.pdf
- 甘草甜素增強NK92-MI細胞殺傷功能機制的研究.pdf
- CD134單抗對SLE患者外周血單個核細胞穿孔素表達及其活性的影響.pdf
- IGF-1促進人NK細胞發(fā)育及殺傷功能.pdf
- Herceptin對NK細胞體外擴增和殺傷活性的影響及機制研究.pdf
- 豬鏈球菌噬菌體穿孔素(holin)的亞細胞定位及拓撲結構.pdf
- 卡介苗免疫小鼠T淋巴細胞亞群及其內穿孔素的表達及意義.pdf
- 紫菜多糖對小鼠NK細胞殺傷活性和淋巴細胞轉化功能的上調作用.pdf
- 調節(jié)性T細胞對NK細胞體外殺傷乳腺癌細胞的影響.pdf
- 淇河鯽穿孔素基因的克隆與表達研究.pdf
- XBFD誘導H22荷瘤小鼠顆粒酶-穿孔素凋亡途徑的分子機制研究.pdf
- 穿孔素、顆粒酶B及MIF在SOJIA發(fā)病中作用的研究.pdf
- 異煙肼對大鼠T淋巴細胞、NK細胞及巨噬細胞功能影響的研究.pdf
評論
0/150
提交評論