h IGF-1基因轉(zhuǎn)染人臍血間充質(zhì)于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:體外研究hIGF-1基因轉(zhuǎn)染人臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)學(xué)方法，檢測(cè)并觀察基因轉(zhuǎn)染后臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)的生物學(xué)變化。
　　 方法:利用密度梯度離心法與細(xì)胞貼壁法相結(jié)合分離培養(yǎng)hUCB-MSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原標(biāo)記。構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒并以X-tremen HP介導(dǎo)將含hIGF-1基因的質(zhì)粒pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ轉(zhuǎn)染hUC-MSCs，倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達(dá)，

2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段細(xì)胞上清液中hIGF-1的濃度，免疫熒光與RT-PCR檢測(cè)hIGF-1在細(xì)胞中的表達(dá)，免疫組化染色檢測(cè)Ⅱ型膠原表達(dá)。
　　 結(jié)果:密度梯度離心法與細(xì)胞貼壁法相結(jié)合可獲得純度較高的hUCB-MSCs，流式細(xì)胞儀細(xì)胞表面抗原標(biāo)志CD90、CD105、CD146表達(dá)陽(yáng)性，CD34、CD45、Anti-HLA-DR表達(dá)陰性。經(jīng)X-tremen HP介導(dǎo)hIGF-1目的基因可導(dǎo)入U(xiǎn)CB-MSCs其轉(zhuǎn)染效

3、率為(28.63±7.59)％，免疫熒光和RT-PCR鑒定均檢測(cè)到hIGF-1的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)閳A形或橢圓形，以后逐漸變?yōu)槎嘟切?。ELISA檢測(cè)hIGF-Ⅰ蛋白質(zhì)分泌在48h達(dá)到高峰(34.68±1.4ng/ml)，與對(duì)照組相比，具有顯著性差異(p＜0.01)。細(xì)胞免疫組化結(jié)果顯示經(jīng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)陽(yáng)性。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-hIGF-Ⅰ，密度梯度離心法與細(xì)胞貼壁法