IGF-1通過JAk-STAT通路促進牙髓細(xì)胞增殖和分化的體外研究.pdf

1、目的:通過觀察JAK-STAT通路抑制劑AG490對IGF-1調(diào)控人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells，HDPCs)增殖、礦化能力及礦化相關(guān)基因的影響，探討JAK-STAT通路在IGF-1促牙髓細(xì)胞增殖和分化中的作用。
　　方法:牙髓細(xì)胞分離培養(yǎng)及來源鑒定:選取因阻生或者正畸減數(shù)拔除的健康恒牙，采用組織塊酶消化法分離、提取牙髓細(xì)胞并進行原代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞增殖并匯合達孔底80％時，用0.25％胰蛋白酶消化并傳代，

2、牙髓細(xì)胞傳至3～4代時，選用免疫組化法檢測波形蛋白和角蛋白表達以鑒定細(xì)胞來源。
　　IGF-1對人牙髓細(xì)胞增殖的影響:以3×103個/孔牙髓細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)24h后，換無血清DMEM饑餓細(xì)胞24h，然后分別用含2％血清濃度的5、10、25、50和100ng/ml IGF-1刺激液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)1d、3d、5d和7d，每3天換一次液，每孔加20μlMTT溶液，4h后吸凈培養(yǎng)液，每孔加150μlDMSO溶液，酶標(biāo)儀以

3、490nm波長檢測各孔吸光度(OD)值。
　　IGF-1誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞增殖過程中JAK-STAT通路的作用:以同樣實驗條件將牙髓細(xì)胞接種于96孔板中，分5組:①對照組②空白對照組③100ng/ml IGF-1組④50μmol/L AG490+100ng/ml IGF-1組⑤50μmol/LAG490組，培養(yǎng)1d、3d、5d和7d采用MTT法檢測細(xì)胞增殖。
　　堿性磷酸酶染色和茜素紅染色分析IGF-1對人牙髓細(xì)胞的礦化作用:以2

4、×105個/孔牙髓細(xì)胞接種于6孔板中，待牙髓細(xì)胞融合至80％時，換成以下4組礦化誘導(dǎo)液①礦化誘導(dǎo)液(Control/M)②100ng/ml IGF-1的礦化誘導(dǎo)液③100ng/ml IGF-1+50μmol/L AG490的礦化誘導(dǎo)液④50μmol/LAG490的礦化誘導(dǎo)液，分別刺激牙髓細(xì)胞7d、14d和21d，在室溫下用4％的多聚甲醛固定30min，分別進行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色分析。茜素紅染色后每孔加入1ml10％氯化十六烷基吡

5、啶，測定562nm波長下OD值。
　　RT-PCR檢測成牙/成骨基因mRNA的表達:在上述4組礦化誘導(dǎo)14d的牙髓細(xì)胞中加入1mlTRIzol，參考TRIzol說明書提取總RNA。根據(jù)M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)操作說明書反轉(zhuǎn)錄獲得單鏈cDNA，使用RT-PCR檢測ALP、OCN、OPN和DSPP的mRNA表達。
　　Western blot及免疫熒光法檢測JAK-STAT通路JAK2蛋白磷酸化水平:用含蛋白磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂

6、解液RIPA將上述4組礦化誘導(dǎo)4h后的牙髓細(xì)胞裂解，提取總蛋白，采用SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜，牛奶蛋白封閉后，分別孵育p-JAK2(1∶1000)與GAPDH(1:1000)一抗及抗兔IgG二抗(1∶20000)，最后用雙色紅外激光掃描儀進行掃膜，Image J軟件分析結(jié)果。將處于對數(shù)生長期的牙髓細(xì)胞消化，以104個/ml濃度的細(xì)胞懸液接種于六孔板中，培養(yǎng)24h后，更換為上述4組礦化誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，用4％多聚甲

7、醛固定細(xì)胞30min，隨后用山羊血清封閉30min，再分別孵育兔抗p-JAK2一抗(1∶100)與抗兔IgG二抗(1∶1000)，最后加入DAPI將細(xì)胞核藍染，立刻在免疫熒光顯微鏡下觀察。
　　用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析及S-N-K法進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.在體外成功分離和培養(yǎng)出人牙髓細(xì)胞，免疫組化法鑒定細(xì)胞證實牙髓細(xì)胞為中胚層間

8、充質(zhì)細(xì)胞來源。
　　2.通過MTT法檢測IGF-1不同濃度(5～100ng/ml)對牙髓細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果為牙髓細(xì)胞培養(yǎng)至第5d和7d時，25、50、100ng/mlIGF-1組增殖均高于對照組(P＜0.05)，并隨濃度升高，細(xì)胞增殖越多，100ng/mlIGF-1組細(xì)胞增殖顯著(P＜0.01)。本實驗發(fā)現(xiàn)IGF-1+AG490組可以明顯抑制牙髓細(xì)胞的增殖作用(P＜0.01)。
　　3.IGF-1組7d、14d及21d形成

9、的礦化結(jié)節(jié)含量及ALP染色均明顯多于Control/M組，而IGF-1+AG490組礦化結(jié)節(jié)形成量較IGF-1組少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.RT-PCR檢測4組礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)14d的人牙髓細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IGF-1組中ALP、OCN、OPN和DSPP的mRNA表達升高，且差異顯著(P＜0.05)，IGF-1+AG490組中ALP、OCN、OPN和DSPP的mRNA水平明顯低于IGF-1組(P＜0.05)，與茜素紅及

10、ALP染色結(jié)果一致。
　　5.礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞4h后，通過Western blot及免疫熒光染色檢測JAK-STAT通路中JAK2蛋白磷酸化水平，結(jié)果顯示IGF-1組磷酸化JAK2(p-JAK2)蛋白表達高于對照組，而IGF-1+AG490組明顯低于IGF-1組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.采用組織塊酶消化法，在體外成功培養(yǎng)出大量人牙髓細(xì)胞，并經(jīng)免疫組化鑒定其來源于中胚間充質(zhì)干細(xì)胞，第3～4代牙髓細(xì)胞增