小鼠肝癌微環(huán)境中肝星狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(簡稱肝癌)是人類最常見的惡性腫瘤之一,因其惡性程度高、預(yù)后差被稱為“癌中之王”。如今,全世界50％以上的新發(fā)和死亡肝癌患者發(fā)生在我國,每年我國大約有30萬人因患肝癌死亡。隨著人們對(duì)腫瘤微環(huán)境研究的深入,認(rèn)為腫瘤是在腫瘤細(xì)胞與其周圍所處的微環(huán)境共同作用下形成的,不再只局限于惡變的細(xì)胞上。腫瘤微環(huán)境是腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中所處的內(nèi)環(huán)境.包括腫瘤細(xì)胞本身、基(間)質(zhì)細(xì)胞、微血管及少量的浸潤細(xì)胞[1]。其中與腫瘤生成與發(fā)展的微環(huán)境最直

2、接相關(guān)的是基質(zhì)細(xì)胞。基質(zhì)細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要調(diào)節(jié)作用。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellatecell,HSCs)是肝臟中最重要的基質(zhì)細(xì)胞,HSCs的持續(xù)激活是肝纖維化進(jìn)程中的中心環(huán)節(jié),與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但HSCs在肝癌免疫應(yīng)答中的作用尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)HSCs具有很強(qiáng)免疫抑制活性,能夠誘導(dǎo)胰島移植物的免疫耐受。但HSCs的這種免疫特性與肝癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系如何呢?為此本文將通

3、過以下三個(gè)部分進(jìn)行闡述與探討。
　　 第一部分小鼠肝星狀細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其免疫特性的研究
　　 目的:探索BALB/c小鼠HSCs分離、培養(yǎng)的方法及活化HSCs的免疫特性。
　　 方法:經(jīng)肝臟原位灌注、膠原酶消化后進(jìn)行密度梯度離心獲得HSCs。結(jié)合光鏡下細(xì)胞的形態(tài)變化及特異性的表面標(biāo)志物結(jié)蛋白和α-SMA表達(dá)鑒定HSCs。同時(shí)通過混合淋巴細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的影響及蛋白芯片檢測(cè)}ISCs分泌的細(xì)胞因

4、子和趨化因子的情況。
　　 結(jié)果:分離培養(yǎng)的HSCs純度大于90％。活化的HSCs高表達(dá)desmin和α-SMA,能夠明顯抑制T細(xì)胞的增殖并分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子。
　　 結(jié)論:活化后的HSCs具有免疫抑制功能,能夠分泌多種生物活性物質(zhì),為后續(xù)開展HSCs免疫調(diào)節(jié)活性與肝癌之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 第二部分活化肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展
　　 目的:HSCs具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)活性,但其免疫活性與肝

5、癌之問的關(guān)系尚不清楚。這一部分主要研究活化的HSCs免疫抑制活性在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 方法:建立正常免疫小鼠皮下肝癌移植模型,將小鼠肝癌細(xì)胞株H22細(xì)胞單獨(dú)或與HSCs聯(lián)合種入小鼠皮下。注射后每2天對(duì)瘤子進(jìn)行大小的測(cè)量。20天后對(duì)荷瘤小鼠行瘤組織解剖,免疫組化檢測(cè)兩組荷瘤小鼠腫瘤組織中Ki67、CD31與VEGF的表達(dá)。同時(shí)通過免疫組織熒光法檢測(cè)T細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞浸潤以及免疫抑制分子B7H1表達(dá)。T

6、UNEL檢測(cè)腫瘤組織中單個(gè)核細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)果:HSCs在體內(nèi)外能夠促進(jìn)肝癌的生長。在小鼠肝癌模型中,共移植HSCs能夠促進(jìn)腫瘤的增殖、新生血管的生成以及營造局部免疫抑制微環(huán)境促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。共移植HSCs抑制腫瘤組織中T淋巴細(xì)胞的浸潤、誘導(dǎo)單個(gè)核細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)B7H1和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)。
　　 結(jié)論:HSCs的免疫抑制活性能夠促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展,從免疫學(xué)角度闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn),

7、靶向微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞-HSCs,為肝癌的治療提供新的思路。
　　 第三部分活化肝星狀細(xì)胞在肝癌微環(huán)境中促進(jìn)免疫抑制性細(xì)胞的表達(dá)
　　 目的:腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制性細(xì)胞足介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的重要因素。HSCs能夠營造免疫抑制微環(huán)境,但HSCs在腫瘤微環(huán)境中與免疫抑制性細(xì)胞之間的關(guān)系尚不清楚。這一部分主要通過建立小鼠原位肝癌移植模型,研究活化的HSCs在腫瘤微環(huán)境中對(duì)免疫抑制性細(xì)胞表達(dá)的影響。
　　 方法:利用原位

8、注射法進(jìn)行小鼠肝癌模型的建立。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)荷瘤小鼠免疫狀態(tài)的變化。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,采用原位肝癌移植瘤模型,分為H22單純注射組與H22+HSCs聯(lián)合注射組。10天后對(duì)荷瘤小鼠行瘤組織解剖測(cè)量移植瘤大小;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組荷瘤小鼠脾臟中T細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及骨髓和脾臟中髓系來源抑制性細(xì)胞MDSCs的表達(dá);同時(shí)免疫組化法檢測(cè)兩組荷瘤小鼠腫瘤組織中Treg細(xì)胞、MDSCs細(xì)胞及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM的表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中,通過混合淋巴實(shí)驗(yàn)

9、分析H22活化的HSCs對(duì)Treg細(xì)胞增殖的影響,并通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)H22活化的HSCs對(duì)MDSCs的誘導(dǎo)作用。
　　 結(jié)果:在小鼠原位肝癌模型中,小鼠肝癌細(xì)胞H22于原位肝臟成瘤性100％,荷瘤小鼠脾臟的重量和脾臟的細(xì)胞量較正常小鼠明顯增加。通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)荷瘤小鼠較正常小鼠脾臟中Treg細(xì)胞表達(dá)增多,而且在脾臟及骨髓中MDSCs細(xì)胞的表達(dá)也明顯增加。
　　 共移植HSCs明顯促進(jìn)肝癌的生長。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示

10、共移植HSCs組較單純注射H22組脾臟中CD3/CD4+T以及CD3/CD8+T細(xì)胞比例明顯降低,Treg細(xì)胞的比例明顯升高;同時(shí)骨髓及脾臟中MDSCs細(xì)胞比例明顯升高。免疫組化檢測(cè)顯示共移植HSCs組肝癌組織中Treg細(xì)胞、MDSCs細(xì)胞及。TAM細(xì)胞明顯增加。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示活化的HSCs能夠促進(jìn)Treg細(xì)胞和MDSCs細(xì)胞的表達(dá),而腫瘤細(xì)胞H122活化后的HSCs對(duì)Treg細(xì)胞和MDSCs細(xì)胞的表達(dá)又進(jìn)一步的增強(qiáng)。