三七蛋白的提取和體外免疫調(diào)節(jié)活性研究

1、1三七蛋白的提取和體外免疫調(diào)節(jié)活性研究三七蛋白的提取和體外免疫調(diào)節(jié)活性研究何慧楠睢博文劉莉齊濱趙大慶（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長(zhǎng)春）摘要摘要:目的提取三七蛋白，并研究其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性。方法采用中性鹽緩沖溶液提取三七蛋白，采用lowry法測(cè)定蛋白含量并利用SDSPAGE電泳法測(cè)定三七蛋白的亞基分子量分布。以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為模型研究三七蛋白對(duì)細(xì)胞吞噬能力的影響，刺激產(chǎn)生NO含量，釋放IL6、TNFα來(lái)考察其對(duì)巨噬細(xì)胞

2、免疫活性的影響。結(jié)果用lowry法測(cè)定三七蛋白的蛋白含量為1.95mgmL，三七蛋白的亞基分子量從18kD到63kD。三七蛋白可通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，釋放免疫因子等方面增強(qiáng)巨噬細(xì)胞免疫活性。關(guān)鍵詞:三七蛋白；巨噬細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)三七為五加科植物三七（Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen）的干燥根及根莖。三七被人們稱為“金不換”，具有止血、散瘀、消腫、止痛等功效[1]。三七中的化學(xué)成分復(fù)雜，主要包括皂苷類、揮發(fā)油

3、類、氨基酸類、黃酮類、糖類、蛋白質(zhì)及多肽、無(wú)機(jī)鹽類等[26]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，三七具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、降血糖等活性，并對(duì)其他藥理活性起著協(xié)同調(diào)節(jié)作用[79]。三七中的皂苷成分被認(rèn)為是三七的主要活性成分，但是近年來(lái)的研究表明，三七多糖等大分子也具有明顯的生物活性[1012]，而這些大分子往往被人們所忽視。本研究針對(duì)三七當(dāng)中的大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提取和性質(zhì)檢測(cè)，并以小鼠巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，對(duì)三七蛋白體外的免疫調(diào)劑活性進(jìn)

4、行初步的探索研究，為把三七蛋白開發(fā)成保健食品的原料提供科學(xué)的依據(jù)。1材料與方法1.1試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基，購(gòu)于Gibco公司，MTT，購(gòu)于Thiazoly公司，DMSO，天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司，TNFα酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒、IL6酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒，購(gòu)自上海朗頓生物科技有限公司，脂多糖（LPS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸鈉（SDS）均購(gòu)于Sigma公司。Infinite200Pro型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，購(gòu)自瑞士TEC

5、AN公司，3111型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自ThermoFma公司。1.2細(xì)胞株小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞株RAW264.7（ATCCTIB71），購(gòu)買于購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1三七蛋白的提取稱取粉碎后的三七粉500g，加入濃度為0.01molL，pH9.0的TrisHCl緩沖溶液5000mL，4℃浸提，浸提24h后，用絹布過(guò)濾浸提液，濾渣加入5000mLTrisHCl緩沖溶液（0.01molL，pH9.0

6、）4℃浸提24h，用兩層絹布過(guò)濾浸提液，合并浸提液，4000rmin離心20min，收集上清。用中空纖維膜過(guò)濾系統(tǒng)超濾（0.45um）和微濾（MW10000）浸提液，收集大分子濾液，向?yàn)V液中緩慢加入(NH4)2SO4，使飽和度達(dá)到75%，4℃沉淀12h后，4000rmin離心20min，收集沉淀，用少量蒸餾水溶解，透析（MW8000），凍干，即得三七總蛋白（NGP）。1.3.2三七蛋白的含量測(cè)定采用lowry法測(cè)定蛋白含量，按照試劑盒使

7、用說(shuō)明書測(cè)定三七蛋白的含量。1.3.3三七蛋白分子量分布測(cè)定采用SDSPAGE電泳測(cè)定三七蛋白的亞基分子量分布。32.2三七蛋白對(duì)細(xì)胞吞噬能力的影響三七蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響如圖2所示，由圖可知，細(xì)胞吞噬能力與樣品濃度呈量效關(guān)系。結(jié)果表明三七蛋白具有增強(qiáng)細(xì)胞吞噬能力的作用（p0.01）。圖2三七蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響2.3三七蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響Griess法測(cè)定NO含量所得標(biāo)準(zhǔn)曲

8、線為y=0.0033x0.0409，R2=0.9997，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得各組NO濃度如圖3所示。由圖可知空白組細(xì)胞產(chǎn)生NO最少，為26.751.22μmolL，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞產(chǎn)生NO最多，為28.471.17μmolL，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞產(chǎn)生NO含量隨三七蛋白濃度的增加而增加。三七蛋白不同濃度與空白組相比均有顯著性（p0.01），且各實(shí)驗(yàn)組NO濃度均低于陽(yáng)性對(duì)照組。圖3三七蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響2.4三七蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞