海珠益肝加味方對免疫性肝損傷小鼠的保護作用及其免疫調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、目的:在我國慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B CHB)的防治雖然取得了一定的進步，但現(xiàn)狀并不是樂觀，約10％～20％慢性乙型病毒性肝炎可發(fā)展為肝硬化，1％～5％慢性乙型病毒性肝炎可演變?yōu)楦伟珻HB的防治形勢依然嚴(yán)峻。因此慢性乙型病毒性肝炎仍然是我國突出的公共衛(wèi)生問題。在慢性乙型病毒性肝炎治療方面，干擾素和核苷類似物無疑是首要選擇，但是干擾素難以適應(yīng)的副作用、基本上需要終身服用的核苷類似物限制自身的使用，很顯然

2、應(yīng)用干擾素和核苷類似物抗乙肝病毒不能解決慢乙肝患者的所有問題。中醫(yī)藥的免疫功能調(diào)節(jié)治療無疑是積極防治慢性乙型病毒性肝炎的有效方法。近些年來，已經(jīng)有許多臨床治療慢性乙型病毒性肝炎的中藥單體或者復(fù)方，但其調(diào)節(jié)免疫功能機理都不是十分清楚。海珠益肝加味方是導(dǎo)師盛國光教授在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，經(jīng)過多年臨床驗證和實驗研究，在海珠益肝方的基礎(chǔ)不斷優(yōu)化的純中藥復(fù)方制劑。海珠益肝加味方由葉下珠、白花蛇舌草、茯苓、海藻、白芥子、莪術(shù)、枸杞、太子參八味藥組成的經(jīng)

3、驗方。具有解毒、化痰、消瘀、補虛的功效。早期研究提示海珠益肝加味方可能通過某些途徑、環(huán)節(jié)和靶點達到雙向調(diào)節(jié)免疫功能的作用，其作用機制很有待于進行深入研究。本課題以免疫肝損傷小鼠動物模型為實驗對象，對海珠益肝加味方進行研究，觀察中藥復(fù)方海珠益肝方加味方對實驗小鼠的免疫狀態(tài)、脾細(xì)胞細(xì)胞因子的mRNA基因表達、輔助性T淋巴細(xì)胞Th1/Th2、To(ll)樣受體(TLR)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，并運用計算機統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理和綜合分析，探討

4、海珠益肝加味方對免疫性肝損傷小鼠的保護作用及其免疫調(diào)節(jié)機制，進一步提高慢性乙型病毒性肝炎的臨床治療水平。
　　 方法:實驗分五個部分進行
　　 第一部分:海珠益肝方及其擴方對Concanavalin A（刀豆蛋白A）誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠的保護作用。
　　 清潔級昆明小鼠100只，隨機分為空白組(1)、模型組(2)、醋酸強的松組(3)、海珠益肝方組(4)、海珠益肝方加太子參枸杞子組(5)、海珠益肝方加太子參仙靈脾組

5、(6)、海珠益肝方加枸杞子仙靈脾組(7)、葉下珠白花蛇舌草組(8)、海藻茯苓白芥子組(9)及莪術(shù)組(10)，每組10只，采用刀豆蛋白A尾靜脈注射法制作免疫性肝損傷動物模型。造模前12天，模型組、空白組給予蒸餾水灌胃，其余組每日分別給予醋酸潑的松、海珠益肝全方、海珠益肝方加太子參枸杞子、海珠益肝方加太子參仙靈脾、海珠益肝方加枸杞子仙靈脾、葉下珠白花蛇舌草、海藻茯苓白芥子及莪術(shù)灌胃。末次灌胃給藥后1h，空白組給予生理鹽水10ml/kg尾靜脈

6、注射，其余各組按照20mg/kg尾靜脈注射刀豆蛋白A造模，禁食自由飲水。造模給藥8h后頸椎脫臼處死動物摘取肝臟和脾臟，生理鹽水中清洗后稱記重量，計算肝脾指數(shù)。肝組織標(biāo)本勻漿離心后取上清液檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)的值。另外取0.2g肝組織固定、脫水、石蠟包埋、切片后行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化。
　　 第二部分:海珠益肝方加味方對Co

7、n A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠血清IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-α的影響。
　　 清潔級昆明小鼠40只，隨機分為空白組(1)、模型組(2)、醋酸強的松組(3)、海珠益肝加味方組(4)，每組10只，采用刀豆蛋白A尾靜脈注射法制作免疫性肝損傷模型。造模前12天，模型組、空白組給予蒸餾水灌胃，其余組每日分別給予醋酸強的松、海珠益肝加味方灌胃。末次灌胃給藥后1h，空白組給予生理鹽水10ml/kg尾靜脈注射，其余各組按照20mg/k

8、g尾靜脈注射刀豆蛋白A造模，禁食自由飲水。造模給藥8h后摘眼球取血，離心后留取血清。采用ELISA方法測定小鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的值。
　　 第三部分:海珠益肝方加味方對Con A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠肝組織病理變化及肝組織NF-KP65的表達水平的影響。
　　 清潔級昆明小鼠40只，隨機分為正常組(1)、模型組(2)、醋酸強的松組(3)、海珠益肝加味方組(4)，每組10只，采用Con A尾靜脈

9、注射法制作免疫性肝損傷模型。造模給藥8h后處死小鼠，取肝組織制作肝臟的超微病理切片，采用電鏡透射法觀察各組肝細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)的病理變化，同時取肝組織用Western-blot法測定小鼠肝組織NF-KP65的表達水平。
　　 第四部分:海珠益肝方加味方對Con A（刀豆蛋白A）誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠脾組織IL-6、TNF-αmRNA影響。
　　 清潔級昆明小鼠40只，隨機分為空白組(1)、模型組(2)、醋酸強的松組(3)、海珠

10、益肝加味方組(4)，每組10只，采用刀豆蛋白A尾靜脈注射法制作免疫性肝損傷小鼠模型。采用RT-PCR法測定小鼠脾組織IL-6、TNF-αmRNA的表達。
　　 第五部分:海珠益肝方加味方對Concanavalin A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠肝組織TLR4、CD14 mRNA影響。
　　 清潔級昆明小鼠40只，隨機分為空白組(1)、模型組(2)、醋酸強的松組(3)、海珠益肝加味方組(4)，每組10只，采用刀豆蛋白A尾靜脈注射法

11、制作免疫性肝損傷模型。采用RT-PCR法測定小鼠肝組織TLR4、CD14mRNA的表達。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:海珠益肝方及其擴方對Con A（刀豆蛋白A）誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠的保護作用。
　　 1.成功建立小鼠免疫性肝損傷模型。與正常組比較，模型組小鼠肝脾指數(shù)、肝組織勻漿后上清液ALT、AST水平及MDA含量均明顯升高(P＜0.05)，肝組織勻漿后上清液SOD水平明顯降低。模型組肝組織內(nèi)大量淋巴細(xì)胞浸潤

12、，部分匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤，肝板消失、凋亡小體散在、肝細(xì)胞成脂肪樣變性。血管周圍的肝細(xì)胞胞漿疏松，染色明顯變淺，肝竇間隙明顯增寬，肝索消失，可見點狀壞死、淋巴細(xì)胞浸潤。
　　 2.與模型組比較，對照組和海珠益肝方加味各組可降低小鼠肝脾指數(shù)，降低肝組織ALT、AST水平及MDA含量，提高肝組織的SOD水平(P＜0.05)，其中以海珠益肝加太子參、枸杞子組更明顯。另外與模型組比較，海珠益肝方加味組肝臟病理變化有不同程度減輕。
　

13、　 第二部分:海珠益肝方加味方對刀豆蛋白A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠血清IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-α的影響。
　　 1.與正常組比較，模型組小鼠血清中IFN-γ、TNF-α的水平明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)。模型組小鼠血清IL-4、IL-6的水平明顯降低，統(tǒng)計學(xué)上差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 2.與模型組比較，對照組和海珠益肝方加味組血清中IFN-γ、TNF-α的水平明顯降低，差異有顯著性(P

14、＜0.05)。對照組和海珠益肝方加味方組小鼠血清中IL-6的水平明顯升高，差異有顯著性(P＜0.05)。對照組和海珠益肝方加味方組小鼠血清中IL-4的水平明顯升高，統(tǒng)計學(xué)差異有顯著性(P＜0.05)。
　　 第三部分:海珠益肝方加味方對Con A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠肝組織病理變化及肝組織NF-KP65的表達水平的影響。
　　 1.正常組肝細(xì)胞核呈圓形及卵圓形，核膜光滑平整，染色質(zhì)均勻分布在核內(nèi)。模型組肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松

15、，出現(xiàn)深淺不一的切跡，胞質(zhì)中常見髓樣體及空泡變性區(qū)，線粒體腫脹，嵴模糊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張。與模型組比較，對照組和海珠益肝方加味組肝細(xì)胞腫脹明顯減輕，未見明顯毛細(xì)膽管擴張，線粒體輕度腫脹，嵴存在，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯擴張。
　　 2.與正常組比較，模型組NF-KP65的水平明顯升高，統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P＜0.05);與模型組比較，對照組和海珠益肝方加味組NF-KP65的水平有明顯變化，統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。
　　 第四部

16、分:海珠益肝方加味方對刀豆蛋白A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠小鼠脾組織IL-6、TNF-αmRNA影響。
　　 1.與正常組比較，模型組IL-6 mRNA的水平有明顯降低，統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P＜0.05);與正常組比較，模型組TNF-αmRNA的水平顯著升高，統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。
　　 2.與模型組比較，對照組和海珠益肝方加味組IL-6 mRNA的水平明顯升高，統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。與模型組比較，對照組

17、和海珠益肝方加味組TNF-αmRNA的水平明顯下降，統(tǒng)計學(xué)有顯著差異(P＜0.05)。
　　 第五部分:海珠益肝方加味方對刀豆蛋白A誘導(dǎo)免疫性肝損傷小鼠肝組織TLR4、CD14 mRNA影響。
　　 1.與正常組比較，模型組TLR4 mRNA的表達水平明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05);與模型組比較，對照組和海珠益肝方加味組TLR4 mRNA的表達水平明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 2.與

18、正常組比較，模型組CD14 mRNA的水平無明顯變化，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理無顯著性差異(P＞0.05);與模型組比較，對照組和海珠益肝方加味組CD14 mRNA的水平無明顯變化，未見明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、海珠益肝方加味對免疫性肝損傷小鼠的肝臟功能有較好的保護作用。
　　 2、海珠益肝方加味對免疫性肝損傷小鼠的肝臟功能有較好的保護作用的機制可能是維持Th1/Th2之間的平衡;抑制過抗的脾臟的細(xì)