TBL的生物活性及其對(duì)樹突狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的研究.pdf

1、植物凝集素是一類非免疫源的蛋白或糖蛋白，能可逆地、特異地與碳水化合物相互作用。它們廣泛分布于動(dòng)植物中。植物凝集素具有：抗蟲、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。利用植物凝集素作為生物機(jī)體中信息媒介這一個(gè)功能，將其應(yīng)用于機(jī)體防御、體外給藥，以及多種疾病的治療具有一定的理論和實(shí)踐意義。
　　本研究通過(guò)Resource?Q離子交換柱和 Superdex?7510/300 GL凝膠過(guò)濾柱對(duì)苦蕎凝集素(Tartary buckw

2、heat lectin, TBL)進(jìn)行兩步純化，制備純度較高的TBL，從對(duì)DCs成熟和增殖的影響及作用機(jī)理，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，防輻射及對(duì)實(shí)體瘤小鼠治療四個(gè)方面對(duì)TBL的生物學(xué)活性進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。
　　(1)采用緩沖液抽提、硫酸銨沉淀、透析及Resource?Q離子交換柱和 Superdex?7510/300 GL凝膠過(guò)濾柱層析等方法從苦蕎麥種子中提取、分離、純化 TBL， SDS-PAGE分析其分子量為65 kDa左右。

3、對(duì)其凝血及酶學(xué)活性、酸堿穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性及金屬離子穩(wěn)定性等性質(zhì)進(jìn)行初步研究。結(jié)果顯示TBL對(duì)4種人類血型、小鼠、大鼠及兔的紅血球均有不同效果的凝集作用，并表現(xiàn)出對(duì)O型人血和兔血的偏好性，TBL對(duì)酸堿及3種金屬離子穩(wěn)定，熱變性溫度為64℃。
　　(2)用50μg/mL的TBL聯(lián)合5×10-5 mol/L重組人白介素4(rhIL-4)刺激未成熟DCs可促進(jìn)外周血中樹突狀細(xì)胞的成熟和增殖，作用強(qiáng)于20 ng/mL的重組人腫瘤壞死因子α

4、(rhTNF-α)。樹突狀細(xì)胞在含50μg/mL TBL的培養(yǎng)基中孵育48 h后，CD83和CD40表達(dá)上調(diào)，并且能釋放促炎因子白介素10(IL-10)和白介素12(IL-12)。
　　(3)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以人淋巴瘤細(xì)胞株U937及小鼠肝癌細(xì)胞株H22為靶細(xì)胞，用不同濃度TBL體外處理，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖、caspase試劑盒活性檢測(cè)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡等方法研究TBL在體外對(duì)兩種不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的

5、影響。結(jié)果顯示TBL在體外對(duì)人淋巴瘤細(xì)胞株U937和小鼠肝癌細(xì)胞株H22有較強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)作用，呈劑量依賴性關(guān)系。TBL還可以誘導(dǎo)人淋巴瘤U937細(xì)胞凋亡，當(dāng)用TBL作用于腫瘤細(xì)胞后，caspase-8和caspase-9同時(shí)被激活，表明TBL可能通過(guò)誘導(dǎo)caspase-9直接激活caspase-8進(jìn)而激活caspase-3來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　(4)采用黃芪、DCs移植及TBL-DCs聯(lián)合移植方法對(duì)醫(yī)用劑量為4 Gy的X射

6、線直線加速器照射小鼠進(jìn)行治療，通過(guò)觀察輻射損傷小鼠WBC和PLT、胸腺和脾指數(shù)、脾淋巴細(xì)胞增殖、外周血淋巴細(xì)胞亞群、骨髓細(xì)胞DNA含量和凋亡的影響來(lái)考查三種治療方案對(duì)輻射損傷造成的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果顯示，黃芪、DCs移植及TBL-DCs聯(lián)合移植都能夠增加受照小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)、血小板數(shù)，提升受輻照小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及脾淋巴細(xì)胞增殖率，其中TBL-DCs移植組效果最好；TBL-DCs聯(lián)合移植對(duì)治療小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4+2

7、5、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞CD16+損傷效果最佳，說(shuō)明TBL-DCs聯(lián)合移植對(duì)受輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有很好的保護(hù)作用。黃芪、DCs移植及TBL-DCs聯(lián)合移植都能夠增加受輻射小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量，而DCs移植及TBL-DCs聯(lián)合移植能降低骨髓細(xì)胞凋亡率，同時(shí)還有降低骨髓細(xì)胞微核率發(fā)生的作用，以TBL-DCs聯(lián)合移植效果最佳；說(shuō)明TBL-DCs聯(lián)合移植能顯著降低輻射導(dǎo)致的DNA損傷。以上表明，TBL-DCs聯(lián)合移植不但對(duì)機(jī)體

8、的造血系統(tǒng)有顯著的保護(hù)作用，而且能夠促進(jìn)受輻射損傷機(jī)體造血功能的恢復(fù)，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，維持DNA微核等遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定，能顯著保護(hù)機(jī)體免受電離輻射損傷。
　　(5)用TBL刺激小鼠DCs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表面抗原Dectin-1、CD40、CD80、CD86和MHCII的表達(dá)，ELISA檢測(cè)Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-6和IL-23，Th1相關(guān)細(xì)胞因子 IL-12和 IFN-γ的分泌水平。實(shí)體瘤小鼠靜脈注射 ABL-DCs結(jié)果顯示