天然反義轉(zhuǎn)錄本DHPS及其靶基因WDR83在胃癌中的表達(dá)調(diào)控及其意義.pdf

1、目的:胃癌發(fā)生中異常表達(dá)的癌基因和抑癌基因除受遺傳學(xué)修飾外,還受表觀遺傳學(xué)調(diào)控。表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾及調(diào)節(jié)性RNA介導(dǎo)基因調(diào)節(jié)。屬于調(diào)節(jié)性RNA之一-天然反義轉(zhuǎn)錄本在真核生物基因組中廣泛存在,在RNA干擾、選擇剪接、X染色體失活、RNA編輯、生長(zhǎng)發(fā)育等方面有重要作用。天然反義轉(zhuǎn)錄本是近五年來表觀遺傳學(xué)研究的新熱點(diǎn),遺憾的是,包括胃癌在內(nèi)的許多腫瘤中天然反義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)調(diào)控情況還不明了,國(guó)內(nèi)甚少學(xué)者涉足該領(lǐng)域。為了解胃

2、癌發(fā)生中相關(guān)基因的天然反義轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)情況,我們通過生物信息學(xué)網(wǎng)站及天然反義轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù)篩選與胃癌發(fā)生相關(guān)的天然反義轉(zhuǎn)錄本,并進(jìn)一步探討它們?cè)谖赴┌l(fā)生發(fā)展中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其意義。
　　方法:我們利用天然反義轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)庫(kù),結(jié)合組織的序列分析基因表達(dá)譜(serialanalysis of gene expression,SAGE)篩選出與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的天然反義轉(zhuǎn)錄本,在胃癌組織中行以實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative re

3、al-time PCR,qRT-PCR)及免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)技術(shù)檢測(cè)天然反義轉(zhuǎn)錄本及靶基因的表達(dá);在胃癌細(xì)胞中,我們用敲除(Knock down)及過表達(dá)(overexpression)天然反義轉(zhuǎn)錄本或靶基因方法來檢測(cè)兩者間的調(diào)節(jié)水平及發(fā)揮作用區(qū)域;用核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、2’-O-methyl oligoribonucleotides抑制實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)(rescue experiment)、

4、α-amanitin干預(yù)實(shí)驗(yàn)、熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)、qRT-PCR及western blot方法來探討兩者間調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果:經(jīng)過篩選初步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,天然反義轉(zhuǎn)錄本DHPS及靶基因WDR83(與細(xì)胞增殖調(diào)控密切相關(guān))成為我們感興趣的一對(duì)天然反義轉(zhuǎn)錄本。在胃癌組織中,DHPS與WDR83在mRNA和蛋白水平均表達(dá)上調(diào),且呈明顯正相關(guān);在胃癌細(xì)胞系中,DHPS可以從RNA和蛋白兩個(gè)水平正向調(diào)節(jié)靶基因WDR83表達(dá),同時(shí)WDR83也

5、可以從RNA和蛋白兩個(gè)水平正向調(diào)節(jié)DHPS表達(dá),DHPS與WDR83間存在著雙向調(diào)控作用,且互補(bǔ)區(qū)3'UTR是發(fā)揮調(diào)控作用的主要區(qū)域;在胃癌細(xì)胞中,我們用核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)(Rnase Protection Experiment)、α-毒蕈堿抑制實(shí)驗(yàn)及寡核苷酸抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)DHPS mRNA與wDR83 mRNA在3’UTR區(qū)形成RNA-RNA二聚體,并增強(qiáng)彼此mRNA穩(wěn)定性;前體mRNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)又提供了DHPS與WDR83的間調(diào)節(jié)主要發(fā)

6、生在轉(zhuǎn)錄后水平;另外,DHPS和wDR83還可以上調(diào)胃癌細(xì)胞增殖力,可能與調(diào)控ERK活性及E2F1表達(dá)相關(guān)。
　　結(jié)論:我們的研究提示天然反義轉(zhuǎn)錄本DHPS及把基因WDR83通過影響胃癌細(xì)胞增殖力而在胃癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在胃癌細(xì)胞中,DHPS與wDR83在mRNA和蛋白水平上存在雙向正向調(diào)控,該雙向調(diào)控主要和二者在互補(bǔ)區(qū)3’UTR形成RNA-RNA二聚體增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性相關(guān)。上述發(fā)現(xiàn)豐富了胃癌的表觀遺傳學(xué)內(nèi)容,并為胃癌發(fā)生