TNFAIP8L1在動脈粥樣硬化中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)與血管內(nèi)皮細胞氧化還原狀態(tài)間的失衡會導致血管細胞功能失調(diào)，作為MAPK家族成員的Erks、JNKs和P38 MAPK在ROS誘導的應激反應中起重要的協(xié)調(diào)作用。PI3K/Akt信號通路、FoxO3a及NF-κB信號通路在氧化應激所誘導的內(nèi)皮細胞凋亡中也起到重要作用。
　　TIPE1(TNFAIP8L1,TNF-α-induced protein8-like1)與TIPE(TNFAI

2、P8)、TIPE2(TNFAIP8L2)、TIPE3(TNFAIP8L3)同為腫瘤壞死因子α誘導蛋白8家族(tumor necrosis factor-alpha-induced protein8(TNFAIP8)family）成員，這四種成員間擁有大量的同源序列。TIPE是這個家族成員中首先被確認的，含有一個死亡結(jié)構(gòu)域并且調(diào)控細胞的生長和凋亡。雖然已有文章報道TIPE1蛋白廣泛表達于C57小鼠組織與細胞系中，但有關其功能研究的文章較少

3、，特別是TIPE1在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用未見報道。因此，本課題以原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮為靶細胞，研究在氧化應激時TIPE1對內(nèi)皮細胞功能的調(diào)控作用，并以高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠誘導動脈粥樣硬化斑塊模型觀察TIPE1的表達在動脈粥樣硬化的發(fā)生進展中所起的作用，以期明確TIPE1在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用并揭示其分子機制。
　　實驗方法:
　　1.細胞實驗研究TIPE1在氧化應激時對血管內(nèi)皮細胞功能的影響
　　1.1

4、.人臍靜脈內(nèi)皮細胞的獲取
　　取自齊魯醫(yī)院健康新生兒臍帶，無菌條件下分離獲取臍靜脈內(nèi)皮細胞，M199培養(yǎng)基加10％胎牛血清進行培養(yǎng)，傳至第三至第十代的細胞用于實驗。
　　1.2.氧化應激對內(nèi)皮細胞表達TIPE1的影響
　　以不同濃度的H2O2刺激內(nèi)皮細胞，或者同一濃度刺激不同的時間，收集洗滌細胞提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進行實時熒光定量PCR或普通PCR，同時收集H2O2處理的細胞提取蛋白進行western b

5、lot檢測TIPE1表達狀況。
　　1.3.氧化應激時TIPE1對血管內(nèi)皮細胞功能的影響
　　1.3.1.TIPE1過表達對血管內(nèi)皮細胞氧化應激時生成ROS及抗氧化酶的影響
　　分別對轉(zhuǎn)染TIPE1表達質(zhì)粒pRK5-TIPE1及空載體pRK5轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞，24小時后，以濃度為100μmol/L H2O2刺激細胞0、30min，收集細胞以流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS的生成情況并分析統(tǒng)計結(jié)果。
　　H2O2分別

6、對轉(zhuǎn)染pRK5及pRK5-TIPE1的細胞刺激0、2h后，收集細胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進行實時定量PCR檢測抗氧化酶CAT、SOD2、GPx的基因表達情況，并收集H2O2刺激0、15、30 min的細胞，westem blot檢測轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a蛋白的活化情況。
　　1.3.2.TIPE1過表達對內(nèi)皮細胞生長的影響
　　運用CCK-8的方法檢測在TIPE1過表達的情況下，細胞的生長情況。
　　1.3.3.TIPE

7、1過表達在氧化應激時對血管內(nèi)皮細胞死亡的影響
　　TIPE1在過表達的情況下，用H2O2刺激細胞，分別用臺盼藍染色、AnnexinV/PI的方法檢測細胞的死亡情況，細胞周期分析TIPE1過表達對細胞周期分布的影響，與轉(zhuǎn)染pRK5組對比分析結(jié)果，得出結(jié)論。此外，用western blot檢測促凋亡分子caspase3的活化、Bax的表達情況及抑凋亡分子Bcl2的表達情況。
　　1.3.4.TIPE1過表達對內(nèi)皮細胞攝取ox-L

8、DL的影響
　　在TIPE1過表達的情況下，用ox-LDL刺激內(nèi)皮細胞，oil-red-O染色，檢測其對ox-LDL的攝取情況。
　　1.4.干擾TIPE1基因?qū)?nèi)皮細胞功能的影響
　　轉(zhuǎn)染TIPE1小干擾RNA及無關對照序列，流式細胞術檢測細胞內(nèi)ROS的生成，CCK-8檢測內(nèi)皮細胞的生長，臺盼藍染色檢測細胞的死亡。
　　1.5.TIPE1在氧化應激時對內(nèi)皮細胞信號通路的影響
　　在TIPE1過表達的情況下

9、，用H2O2刺激內(nèi)皮細胞，提取總蛋白，通過westernblot方法，檢測Akt、MAPK、IκB信號通路的活化情況。
　　2.體內(nèi)實驗
　　購自北京科奧協(xié)力公司6-8w齡健康雄性ApoE-/-小鼠，分為實驗組和對照組，在高脂喂養(yǎng)一周后，分別對兩組注射TIPE1慢病毒和對照慢病毒。在高脂喂養(yǎng)8w后，處死小鼠，取其心臟主動脈根部冰凍切片以進行油紅O染色和HE染色，腹主動脈以進行大體油紅O染色，留取血清檢測脂蛋白水平。
　

10、　研究結(jié)果:
　　1.氧化應激上調(diào)內(nèi)皮細胞表達TIPE1
　　在H2O2刺激內(nèi)皮細胞不同時間后，無論其基因水平還是蛋白水平，H2O2都能促進TIPE1的表達，呈時間和劑量依賴性。
　　2.TIPE1促進H2O2誘導的活性氧的產(chǎn)生
　　因文獻報道H2O2可以直接引起氧化應激并且產(chǎn)生過多的ROS，因此，在TIPE1過表達的情況下，用H2O2刺激細胞，流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS的生成情況以確定TIPE1對H2O2誘導的

11、ROS產(chǎn)生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在沒有H2O2刺激的情況下，TIPE1本身就可以促進ROS的產(chǎn)生;H2O2刺激后，TIPE1過表達的細胞內(nèi)ROS的濃度大幅度提高。
　　3.TIPE1過表達抑制氧化應激時抗氧化酶的表達
　　TIPE1過表達后，H2O2刺激內(nèi)皮細胞，檢測細胞內(nèi)過氧化物酶的基因表達情況發(fā)現(xiàn)TIPE1有效的降低了CAT、SOD2、 GPx基因的表達，F(xiàn)oxO3a的磷酸化活化水平降低，說明TIPE1過表達抑制氧化應激時抗氧

12、化酶的表達。
　　4.TIPE1抑制內(nèi)皮細胞生長
　　TIPE1過表達后，CCK-8方法檢測在H2O2刺激后不同時間其OD的變化情況，發(fā)現(xiàn)TIPE1本身可以抑制細胞生長，而在H2O2刺激后，TIPE1過表達的細胞其生長增殖速度更低，由此可知，TIPE1在氧化應激時抑制內(nèi)皮細胞生長。
　　5.TIPE1過表達在氧化應激時促進內(nèi)皮細胞的死亡
　　5.1.臺盼藍染色中TIPE1促進氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞死亡
　　

13、TIPE1過表達后，H2O2刺激不同時間下用臺盼藍染色發(fā)現(xiàn)TIPE1過表達的細胞其死亡率明顯增加。
　　5.2.Annexin V/PI中TIPE1在氧化應激時促進內(nèi)皮細胞的凋亡
　　TIPE1過表達后，H2O2刺激促進了內(nèi)皮細胞Annexin V與PI雙染所占總細胞的比例，促凋亡分子caspase3的活化及Bax的表達均增高，而抗凋亡蛋白Bcl2的顯著降低，細胞周期分析發(fā)現(xiàn)，H2O2刺激促進了內(nèi)皮細胞PI染色所表示的凋亡峰

14、所占各細胞周期的比例，這些結(jié)果提示TIPE1過表達促進氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞死亡。
　　6.TIPE1過表達促進內(nèi)皮細胞對ox-LDL的攝取
　　在TIPE1過表達的情況下，用ox-LDL刺激內(nèi)皮細胞，油紅O染色，檢測其ox-LDL吸收情況。發(fā)現(xiàn)TIPE1過表達后促進了內(nèi)皮細胞對ox-LDL的攝取。
　　7.siRNA沉默TIPE1基因?qū)?nèi)皮細胞功能的影響
　　在TIPE1基因沉默情況下，F(xiàn)CM檢測胞內(nèi)ROS水平

15、明顯低于對照細胞，細胞生長較對照細胞增快，細胞死亡明顯低于轉(zhuǎn)染對照無關序列的細胞，由此可進一步說明TIPE1能夠促進氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞死亡。
　　8.TIPE1在氧化應激時通過調(diào)控Akt、MAPK、IκB信號通路促進內(nèi)皮細胞的死亡
　　通過westem blot檢測H2O2刺激TIPE1過表達的細胞其Akt、MAPK、IκB信號通路活化情況與對照組比較，可以發(fā)現(xiàn)TIPE1抑制p-Akt、p-IκB、p-Erk的活化而促進

16、p-P38、p-JNK的活化，以此調(diào)控在氧化應激時TIPE1所促進的細胞死亡。
　　9.TIPE1蛋白促進ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發(fā)生
　　通過對主動脈根部冰凍切片進行油紅O染色及HE染色，以及對腹主動脈進行大體油紅染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射高效表達TIPE1蛋白的慢病毒的小鼠體內(nèi)斑塊沉積情況明顯較注射對照慢病毒的小鼠嚴重，TIPE1對小鼠血糖、血清總膽固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白的分泌沒有影響，而對甘油三酯和游離脂肪酸

17、的分泌起到促進作用。提示TIPE1可以促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。
　　結(jié)論:
　　1.動物實驗證實TIPE1具有促進動脈粥樣硬化效應;
　　2.TIPE1促動脈粥樣硬化的機制與TIPE1調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的氧化應激效應有關，具體表現(xiàn)為:H2O2誘導內(nèi)皮細胞氧化應激時上調(diào)TIPE1表達，且呈時間和劑量依賴性;表達的TIPE1蛋白抑制內(nèi)皮細胞的生長，促進氧化應激誘導的內(nèi)皮細胞死亡，促進內(nèi)皮細胞對ox-LDL的攝取;