樹突狀細(xì)胞在兔動(dòng)脈粥樣硬化模型中作用的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究從選擇合適動(dòng)脈硬化動(dòng)物模型出發(fā)，以期在合適的動(dòng)脈斑塊中檢測(cè)炎癥及樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）成熟狀況，并檢測(cè)AS動(dòng)物模型中可能存在的危險(xiǎn)因素與DCs成熟的關(guān)系，探討DCs在易損斑塊形成過程中的作用，為冠心病免疫發(fā)病機(jī)制的闡明奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本課題分為三個(gè)部分，首先以兔腹主動(dòng)脈粥樣硬化模型為研究對(duì)象，應(yīng)用病理切片、血管造影及體外超聲檢測(cè)斑塊成膜情況，分析其斑塊性質(zhì)，建立研究模型基礎(chǔ)；從建立的A

2、S實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出發(fā)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組織化學(xué)觀察DCs在血液、血管組織、脾臟和肝臟及淋巴結(jié)的分布情況，重點(diǎn)觀察DCs的分布情況對(duì)AS發(fā)生發(fā)展的影響；體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨髓源DCs，并通過ELISA、流式細(xì)胞技術(shù)及免疫檢測(cè)技術(shù)觀察模型動(dòng)物的自體血清與ox-LDL刺激對(duì)DCs成熟誘導(dǎo)情況，以明確AS動(dòng)物模型中DCs與典型斑塊形成的可能機(jī)制。 結(jié)果分述如下: 1．新西蘭兔的模型制備及相關(guān)檢測(cè)。 1．1 動(dòng)脈粥樣硬化新西

3、蘭兔成模情況及各組兔一般情況的比較： 16只雄性純種新西蘭白兔，體重2．50±0．14kg，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各組予以腹主動(dòng)脈內(nèi)膜的球囊損傷后，實(shí)驗(yàn)組以高脂飲食喂養(yǎng)2月，對(duì)照組則以正常飲食喂養(yǎng)2月。給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)2月，喂養(yǎng)后兔的體重較喂養(yǎng)前在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均數(shù)均明顯增加，差異有顯著性意義（P=0．000）；實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)后較喂養(yǎng)前的TC、TG、LDL均數(shù)增高，差異有顯著性意義（P=0．000）；實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)后與對(duì)照組喂養(yǎng)后

4、比較，其TC、TG、LDL均數(shù)明顯增高，差異有顯著性意義（P=0．000）。 1．2 各組新西蘭白兔腹主動(dòng)脈造影及外周血管超聲情況的比較： 兩組新西蘭白兔喂養(yǎng)2月后，行腹主動(dòng)脈造影檢查及外周血管超聲檢查，分別比較喂養(yǎng)2月后兩組新西蘭白兔腹主動(dòng)脈硬化斑塊形成對(duì)動(dòng)脈管腔變化的影響，并觀察麥角新堿對(duì)球囊剝脫部位誘發(fā)痙攣情況的比較。 在腹主動(dòng)脈造影下，測(cè)量藥物刺激后血管收縮率，t檢驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組的損傷部位和未損傷部位之間以

5、及實(shí)驗(yàn)組的損傷部位與對(duì)照組的損傷部位之間血管收縮率差異存在顯著性意義（P=0．000）。 以體表超聲評(píng)價(jià)血管偏心指數(shù)（斑塊偏心指數(shù)=斑塊最厚處斑塊厚度/該部位對(duì)側(cè)斑塊最薄處斑塊厚度）。結(jié)果顯示偏心指數(shù)較大的斑塊在藥物刺激后血管收縮明顯增加，偏心指數(shù)與血管收縮率之間呈顯著正相關(guān)（r=0．983，P=0．000）。 1．3 各組新西蘭白兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜增生情況比較： 兩組新西蘭白兔喂養(yǎng)2月后，分別留取球囊剝脫部位及臨近

6、剝脫部位的腹主動(dòng)脈血管標(biāo)本。比較喂養(yǎng)2月兩組新西蘭白兔主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)，實(shí)驗(yàn)組光鏡下見中膜和內(nèi)膜均明顯增厚，有較多增生的血管平滑肌細(xì)胞，呈環(huán)形排列整齊，新生內(nèi)膜中有大量細(xì)胞外基質(zhì)形成，管腔明顯狹窄。各種參數(shù)如內(nèi)彈力膜環(huán)繞總面積、新生內(nèi)膜面積、管腔面積及內(nèi)膜增生百分比的結(jié)果比較，四組之間明顯差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組球囊剝脫部位與臨近剝脫部位和對(duì)照組相比，新生內(nèi)膜面積顯著增大，差異有顯著性意義（P=0．004），管腔面積顯著減小，差異有顯

7、著性意義（P=0．000），內(nèi)膜增生百分比明顯增大，差異有顯著性意義（P=0．001）。說明實(shí)驗(yàn)組新西蘭白兔球囊剝脫部位的主動(dòng)脈內(nèi)膜有新生內(nèi)膜形成。 1．4 各組新西蘭白兔血清NO水平及血管標(biāo)本內(nèi)eNOS酶蛋白表達(dá)的比較： 采用硝酸還原酶法對(duì)兩組新西蘭白兔喂養(yǎng)2月后的血清NO水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，血清NO水平下降的差異有顯著性意義（P=0．002）。 采用免疫組化對(duì)各組血管組織中eNOS酶蛋白

8、含量和定位進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示對(duì)照組血管組織中，內(nèi)皮細(xì)胞有陽(yáng)性著色，球囊剝脫部位與臨近剝脫部位內(nèi)皮細(xì)胞陽(yáng)性著色點(diǎn)無明顯差異；實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比球囊剝脫部位內(nèi)膜的陽(yáng)性著色減少，內(nèi)皮下層出現(xiàn)散在的陽(yáng)性著色點(diǎn)，而臨近球囊剝脫部位內(nèi)膜陽(yáng)性著色點(diǎn)較對(duì)照組無明顯差異。說明高脂血癥可以導(dǎo)致血漿NO水平下降，但對(duì)血管內(nèi)皮eNOS酶表達(dá)無明顯影響，只有在血管內(nèi)皮損傷后，血漿膽固醇進(jìn)入內(nèi)膜進(jìn)一步演變成有害膽固醇蛋白，進(jìn)而對(duì)內(nèi)皮功能產(chǎn)生影響。 2．兔動(dòng)

9、脈粥樣硬化與炎癥及細(xì)胞免疫的關(guān)系。 通過ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組血漿炎癥因子表達(dá)水平，并流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法，分析AS動(dòng)物模型血管壁內(nèi)DCs及免疫細(xì)胞的分布，觀察是否存在與正常對(duì)照組之間的區(qū)別。 2．1 血生化指標(biāo)及炎癥指標(biāo)的檢測(cè)： 制備模型2月后，通過ELISA方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血漿炎癥因子表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組兔血清sICAM、sVCAM、IL-6、TNF、hsCRP的含量與對(duì)照組相比，存在顯著性差異（

10、P<0．01）。提示在兔動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中存在炎癥反應(yīng)，黏附分子與CRP等炎癥因子共同促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。 2．2 兔DCs表型分子S100及抗原呈遞細(xì)胞活性分子CD86、MHCⅡ分別在兩組剝脫及未剝脫血管部位的表達(dá)情況： 制備模型2月后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組血管剝脫部位的CD86、MHCⅡ、S100含量分別與未剝脫部位、對(duì)照組剝脫部位的血管相比明顯升高，差異有顯著意義（P<0．01）；CD86、MH

11、CⅡ、S100的含量在實(shí)驗(yàn)組未剝脫部位、對(duì)照組剝脫部位及未剝脫部位的血管兩兩之間，差異無顯著性意義（P>0．05）。在模型兔剝脫部位血管壁組織內(nèi)檢測(cè)到兔特異性的DCs標(biāo)記分子明顯增多，說明實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照兔腹主動(dòng)脈血管壁內(nèi)DCs明顯升高；而檢測(cè)抗原呈遞細(xì)胞活性分子CD86及MHcn含量也較對(duì)照組明顯升高，說明抗原呈遞細(xì)胞活化與AS的進(jìn)展高度相關(guān) 3．兔外周血來源的DCs可以在模型自體血清及AS相關(guān)物質(zhì)刺激下誘導(dǎo)成熟，并具有誘導(dǎo)T細(xì)胞

12、增殖的能力。 制模前兔外周血來源的DCs分為4組，空白組予以PBS干預(yù)，對(duì)照組予以制模前的兔自體血清干預(yù)（10%），實(shí)驗(yàn)組予以制模后兔自體血清干預(yù)（10%），ox-LDL組予以ox-LDL（10 μg/mL）干預(yù)。 3．1 兔外周血源的DCs培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定： 兔外周血源的DCs在光學(xué)顯微鏡下可見懸浮生長(zhǎng)，部分細(xì)胞聚集成簇，細(xì)胞表面有數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起；在掃描電鏡下細(xì)胞呈不規(guī)則形，表面粗糙，胞體有形態(tài)

13、不一的突起。 3．2 各組兔外周血源的DCs的表型流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)： 空白組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組以及ox-LDL組的兔外周血源的細(xì)胞培養(yǎng)前后的表型流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果經(jīng)One-Way ANOVA檢驗(yàn)顯示：MHCⅡ（P=0．000）、CD86（P=0．001）、CD14 （P=0．000）在各自的不同組間的差異有顯著性意義，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與ox-LDL組的MHCⅡ、CD86的表達(dá)較空白組上調(diào)，差異有顯著性意義（P<0．05），實(shí)驗(yàn)

14、組與ox-LDL組的CD14表達(dá)下調(diào)明顯，差異有顯著性意義（P<0．01）。對(duì)照組表現(xiàn)為CD86+/MHCⅡ+/CD14dim，區(qū)別于空白組單核／巨噬細(xì)胞的MHCⅡ+/CD14+的表型特征。在實(shí)驗(yàn)組自體血清環(huán)境以及ox-LDL組的ox-LDL刺激后，MHC Ⅱ和CD86表達(dá)繼續(xù)上調(diào)，CD14+/dim則轉(zhuǎn)化為CD14-，其MHC Ⅱ+/CD86+/CD14-的表達(dá)為成熟樹突狀細(xì)胞的表現(xiàn)。 3．3 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)： 各組

15、的兔細(xì)胞按照不同比例（1：10、1：50、1：100）與同種異源的T淋巴細(xì)胞混合，加DMSO后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490nm的A值。結(jié)果顯示各組均可產(chǎn)生不同程度的增殖反應(yīng)，析因分析表明混合比例因素（P=0．000）和分組因素（P=0．000）對(duì)MLR的結(jié)果影響均有顯著性意義，且1：10的比例時(shí)增殖反應(yīng)最強(qiáng)。One-Way ANOVA檢驗(yàn)各組在不同混合比例下的差異，實(shí)驗(yàn)組（P=0．026）各比例間差異有顯著性意義。One-Way ANOVA檢

16、驗(yàn)不同比例的MLR在各組之間的差異，結(jié)果提示在1：10及1：50混合比例時(shí)各組之間比較有顯著性意義（P=0．002），且ox-LDL組和實(shí)驗(yàn)組較空白組具有更強(qiáng)的刺激異體淋巴細(xì)胞增殖的能力，比較有顯著性意義（P<0．05），說明經(jīng)高脂血清環(huán)境培養(yǎng)的DCs與ox-LDL刺激生成的DCs具有更強(qiáng)的抗原提呈能力，并且隨著DCs數(shù)量的增多，刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)。 通過上述三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)，得出以下結(jié)論： 1.通過球囊內(nèi)

17、皮剝脫并高脂飲食2月后，可形成明確的兔腹主動(dòng)脈硬化斑塊，該斑塊具有顯著的內(nèi)膜增生、管腔狹窄等特點(diǎn)； 2.模型兔腹主動(dòng)脈斑塊具有部分類似人動(dòng)脈硬化的特點(diǎn)，體表超聲顯示該斑塊呈密度低、偏心形等特點(diǎn)，麥角新堿誘發(fā)下腹主動(dòng)脈造影顯示球囊內(nèi)皮剝脫部位可誘發(fā)明顯的血管痙攣； 3.斑塊形成部位eNOS減少說明斑塊部位內(nèi)皮功能嚴(yán)重受損； 4.模型兔血漿炎癥因子分泌增多，說明炎癥與AS形成高度相關(guān)； 5.模型兔血管壁DCs