ADF-destrin在內耳異位再生毛細胞的發(fā)育表達以及相關功能研究.pdf

1、哺乳動物耳蝸毛細胞再生能力非常有限，通過基因或藥物的干預可能促使一定程度的修復。對轉基因小鼠進行實驗研究發(fā)現細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑(CDKI) p27以及視網膜母細胞瘤(Rb)蛋白是哺乳動物支持細胞重新進入細胞周期的重要調節(jié)因素。為了讓毛細胞在損傷后得以修復，這些蛋白可能成為短暫性基因敲減的靶標。此外，通過逆轉錄病毒介導Atoh1轉錄因子能夠使部分成熟支持細胞轉分化為毛細胞。但是，異位再生毛細胞在其發(fā)育過程中是否也發(fā)生發(fā)育過程中的平

2、面細胞極性(PCP)改變備受關注。
　　ADF/destrin是肌動蛋白解聚因子家族中的一員，其它成員還包括cofilin1(n-cofilin)以及cofilin2。研究表明該家族成員可結合絲狀肌動蛋白增加肌動蛋白解聚的效率，加速肌動蛋白更新周轉，從而影響細胞骨架的重塑和細胞的主動運動，同時n-cofilin在果蠅的同類物tsr經研究證實為果蠅翅毛PCP過程以及光感受器匯聚伸展過程所需要。已有研究對小鼠耳蝸、前庭橢圓囊、球囊以及

3、螺旋神經元在發(fā)育過程ADF/destrin的分布做了詳細分析。但目前尚未有ADF/destrin在內耳半規(guī)管壺腹感覺上皮的發(fā)育分布報道以及ADF/destrin與過表達Atoh1誘導再生毛細胞之間的相關研究，有關再生毛細胞纖毛極性發(fā)育以及PCP相關蛋白對該發(fā)育過程的功能影響也研究甚少。
　　本研究中，我們主要通過免疫熒光染色和激光共聚焦顯微鏡觀察的方法比較了正常發(fā)育階段從胚胎期第14.5天(E14.5)到出生后4天(P4)小鼠內耳

4、耳蝸聽覺上皮、前庭橢圓囊感覺上皮、半規(guī)管壺腹感覺上皮中ADF/destrin的定位分布以及體外離體培養(yǎng)耳蝸基底膜經轉染腺病毒過表達Atoh1誘導的大上皮嵴異位再生毛細胞在培養(yǎng)第6天和第12天ADF/destrin以及極性相關蛋白γ-tubulin的表達定位變化。結果顯示在內耳耳蝸聽覺上皮中ADF/destrin在胚胎期14.5天(E14.5)主要分布于小部分毛細胞和支持細胞表皮板邊緣，胚胎期18.5天(E18.5)和出生后1天(P1)主

5、要分布于毛細胞表皮板和支持細胞表皮板及胞體，出生后4天(P4)只存在于支持細胞，毛細胞內不表達;在內耳前庭橢圓囊感覺上皮中ADF/destrin在E14.5主要存在支持細胞胞體及部分表皮板邊緣，毛細胞不表達，E18.5時分布于支持細胞胞體以及部分毛細胞動纖毛上，P1時主要分布于毛細胞及其動纖毛上，支持細胞不表達，出生后4天(P4)則只分布于支持細胞;在內耳水平半規(guī)管壺腹感覺上皮中ADF/destrin在E14.5主要分布在支持細胞表皮板

6、邊緣以及少量微絨毛上，E18.5時主要分布于支持細胞胞體，毛細胞不表達，P1時仍然主要分布于支持細胞中，但壺腹嵴外側毛細胞及其動纖毛開始表達ADF/destrin。隨后我們通過體外培養(yǎng)剛出生2-3天小鼠耳蝸基底膜并轉染腺病毒過表達Atoh1誘導大、小上皮嵴產生異位再生毛細胞，培養(yǎng)第6天時ADF/destrin在部分Myo7a(+)細胞中有表達，培養(yǎng)第12天時ADF/destrin在Myo7a(+)細胞中幾乎沒有分布，而是存在于非Myo7

7、a(+)細胞中。異位再生Myo7a(+)細胞在離體培養(yǎng)過程中ADF/destrin的分布變化與正常發(fā)育的耳蝸聽覺上皮毛細胞在胚胎期(E14.5-E18.5)表達而出生后(P1-P4)不表達destrin的現象一致。
　　PCP信號通路被證實在哺乳動物內耳發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，它指導內耳感覺上皮匯聚伸展并形成方向統(tǒng)一的階梯狀靜纖毛束，而肌動蛋白重塑密切參與了細胞極化和PCP核心蛋白的重分布機制。我們研究結果發(fā)現過表達Atoh1誘

8、導的異位再生毛細胞在培養(yǎng)不同時間其基體位置發(fā)生遷移，在過表達Atoh1早期（轉染腺病毒后培養(yǎng)1周以內），γ-tubulin所標記的纖毛基體出現在單個異位再生Myo7a(+)細胞的中部，培養(yǎng)1周之后單個異位再生Myo7a(+)細胞基體移至細胞邊緣。
　　此外，本研究還發(fā)現，剛出生小鼠耳蝸基底膜離體培養(yǎng)條件下，Testosterone-BSA處理組小上皮嵴細胞(lesser epithelial ridge，LER)的BrdU陽性率相