小鼠內(nèi)毛細(xì)胞CME相關(guān)蛋白Myosin6-Dab2的表達(dá)研究.pdf

1、背景:
　　感音神經(jīng)性聾的發(fā)病機(jī)制是神經(jīng)生理及耳科學(xué)研究的熱點(diǎn)方向[1]。聽信號(hào)的傳遞依靠?jī)?nèi)毛細(xì)胞中數(shù)量眾多的囊泡不斷地量子化釋放，借此保證突觸間隙充足的遞質(zhì)能和突觸后受體結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)聽神經(jīng)動(dòng)作電位。穩(wěn)定囊泡池(vesicle pool)中的囊泡數(shù)量需依賴IHC高效的囊泡循環(huán)再生[2]。囊泡循環(huán)(vesicle cycling)過程大體上可以分為囊泡釋放（胞吐）和囊泡回收(內(nèi)吞再生）兩個(gè)主要環(huán)節(jié)[3]，高效的囊泡循環(huán)是內(nèi)毛細(xì)胞正

2、常突觸活動(dòng)的基礎(chǔ)。
　　囊泡內(nèi)吞(vesicle endocytosis)構(gòu)成補(bǔ)充囊泡數(shù)量的必要條件，此外它還關(guān)乎著突觸傳遞的可塑性、強(qiáng)度及學(xué)習(xí)記憶等過程。神經(jīng)突觸的囊泡同收模式眾多，其中的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(CME)對(duì)于穩(wěn)定突觸功能具有重要意義[4]。有關(guān)中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，Myosin6蛋白為調(diào)控CME過程的馬達(dá)蛋白，其通過分子尾端綁定信號(hào)蛋白Disabled-2(Dab2)，隨即嵌入內(nèi)吞所形成的囊泡凹陷結(jié)構(gòu)中，借此錨定囊泡

3、于微絲，繼而利用ATP，為囊泡形成并沿微絲向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)提供機(jī)械動(dòng)力[5]。囊泡膜高水平Dab2蛋白為募集Myosin6參與CME過程的特征信號(hào)，其影響Myosin6功能的發(fā)揮及分子二聚體的半哀期[6]。
　　由于耳蝸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，細(xì)胞體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)尚未成功致使毛細(xì)胞囊泡相關(guān)研究進(jìn)展緩慢。從細(xì)胞功能來看，現(xiàn)有的研究主要圍繞帶狀突觸結(jié)構(gòu)及囊泡釋放等環(huán)節(jié)，而釋放出的囊泡膜是如何被回收至胞質(zhì)中的，哪些蛋白參與內(nèi)吞以及囊泡內(nèi)吞在哪些亞細(xì)胞部位均有

4、待揭示;另外，CME對(duì)毛細(xì)胞代謝過程的意義，CME與內(nèi)毛細(xì)胞突觸活動(dòng)關(guān)系等問題迄今為止尚不明確。在分子功能方面，值得注意的是既往針對(duì)Myosin6分子力學(xué)特性的研究豐富，但有關(guān)耳蝸中的研究?jī)H僅證實(shí):1）該蛋白表達(dá)于耳蝸毛細(xì)胞，基因MYO6變異與表型為DFNA22、DFNB37（分別為常隱、常顯）兩型遺傳性耳聾有關(guān)，2）根據(jù)胞內(nèi)表達(dá)定位推測(cè)其功能為錨定纖毛;但既往理論并不能解釋MYO6基因突變鼠IHC突觸前膜形態(tài)改變、發(fā)育障礙、突觸區(qū)囊泡

5、數(shù)量變化及囊泡補(bǔ)充受損等現(xiàn)象[7]。Myosin6在毛細(xì)胞內(nèi)的功能存在其他可能，且這些功能與聽覺發(fā)育以及維持IHC復(fù)雜的生命活動(dòng)有關(guān)。
　　目的:
　　1)本實(shí)驗(yàn)通過免疫熒光標(biāo)記，激光共聚焦顯微鏡觀察Myosin6及Dab2兩個(gè)CME相關(guān)蛋白在KM小鼠耳蝸毛細(xì)胞的表達(dá)及定位;再以年齡為分組指標(biāo)，分別采用圖像分析軟件及熒光qRT-PCR兩種半定量方法研究比較出生后小鼠耳蝸中兩個(gè)蛋白基因的表達(dá)水平變化趨勢(shì)?；诘鞍鬃陨硖攸c(diǎn)，我們

6、想探討耳蝸IHC是否有類似的CME過程，CME過程的主要部位以及蛋白表達(dá)水平變化與聽覺發(fā)育成熟的關(guān)系。
　　2)氯丙嗪能夠抑制多種體外培養(yǎng)細(xì)胞的CME過程，而機(jī)制可能是通過鈣調(diào)蛋白途徑降低Myosin6的分子活性。本實(shí)驗(yàn)通過全細(xì)胞膜片鉗比較了接受藥物灌流細(xì)胞與正常細(xì)胞在鈣電流Ica2+和膜電容△Cm兩個(gè)方面的差異，以期探討Myosin6功能抑制后，CME出現(xiàn)異常對(duì)IHC電生理活動(dòng)的影響，證實(shí)正常CME對(duì)于維持細(xì)胞突觸活動(dòng)的重要性。

7、
　　方法:
　　1.材料:實(shí)驗(yàn)用健康昆明(KM)小鼠共60只，分為四個(gè)年齡組（各組15只）:出生后2周齡、5周齡、9周齡、16月齡小鼠。實(shí)驗(yàn)用蛋白一抗購(gòu)于Santa Cruz公司，熒光二抗購(gòu)于Abbkine公司。熒光定量逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑購(gòu)于Takara公司。
　　2.顯微解剖并分離小鼠耳蝸基底膜。
　　3.免疫熒光染色制備基底膜鋪片。
　　4.激光共聚焦顯微鏡觀察（保持激發(fā)光波長(zhǎng)以及檢測(cè)器增益一致）。應(yīng)用Z

8、ENlite2012(ZEISS)軟件比較測(cè)定IHC核上區(qū)及核下區(qū)Myosin6蛋白熒光平均強(qiáng)度值(intensity mean value，IMV)以及不同年齡組內(nèi)毛細(xì)胞Myosin6蛋白熒光IMV值。
　　5.qRT-PCR測(cè)定比較四個(gè)年齡組兩蛋白mRNA的表達(dá):抽提RNA并逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR，測(cè)CT值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并以Livak歸納方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量RQ值(relativequantity,RQ)，以9周齡小鼠作為對(duì)照組，

9、比較其他三組與對(duì)照組兩個(gè)蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異。
　　6.ABR評(píng)估不同年齡組小鼠聽閾值。
　　7.將IHC急性分離后，采用全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)對(duì)照組和氯丙嗪灌流組的鈣電流和膜電容，比較差異。
　　8.統(tǒng)計(jì)分析:采用SPSS18.0軟件，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)選用t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行，P＜0.05為差異顯著。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光染色結(jié)果（圖1）:Myosin6、Dab2蛋白主要表達(dá)于耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞，

10、尤其在內(nèi)毛細(xì)胞有著顯著表達(dá)，而基底膜上其他細(xì)胞如支持細(xì)胞未見表達(dá)。通過軟件比較后發(fā)現(xiàn)，Myosin6蛋白熒光在IHC核上區(qū)強(qiáng)于核下區(qū)。分層掃描后發(fā)現(xiàn)，IHC頂區(qū)Dab2強(qiáng)表達(dá)，即表皮板及局部胞質(zhì)所在區(qū)域，而OHC中也存在局部高表達(dá)區(qū)。
　　2.比較各個(gè)年齡組蛋白熒光強(qiáng)度（圖2、圖3）:隨機(jī)從每組Myosin6圖像中選取5個(gè)IHC，截取其核上核下區(qū)2個(gè)等面積區(qū)域，ZENlite軟件測(cè)算各區(qū)域IMV值。2周齡小鼠IHC區(qū)有斑點(diǎn)狀熒光，

11、強(qiáng)度明顯低于其他三組，16月齡組Myosin6熒光強(qiáng)度IMV低于5周齡組及9周齡組(P＜0.01)，而5周齡組和9周齡組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。對(duì)比Dab2蛋白熒光圖發(fā)現(xiàn)，各組均可見IHC頂區(qū)熒光局部增強(qiáng)區(qū)域，2周齡組Dab2熒光強(qiáng)度低于其他三組。
　　3.qRT-PCR半定量分析比較不同年齡小鼠蛋白mRNA表達(dá):我們發(fā)現(xiàn)2周齡組兩個(gè)蛋白的RQ值均小于9周齡組（P均＜0.05），而5周齡組和16月齡組兩蛋白的RQ值分

12、別與9周齡小鼠相比，兩組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　4.ABR測(cè)試四個(gè)年齡組小鼠的聽閾值:2周齡組結(jié)果未見穩(wěn)定ABR波形。16月齡鼠ABR閾值分別較9周齡及5周齡鼠增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），而5周齡和9周齡小鼠之間閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.氯丙嗪灌流后，全細(xì)胞膜片鉗初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)毛細(xì)胞內(nèi)向鈣流減弱，膜電容值下降。
　　結(jié)論:
　　1)根據(jù)CME相關(guān)

13、兩個(gè)蛋白的表達(dá)及Dab2蛋白于內(nèi)毛細(xì)胞頂區(qū)存在的局部高表達(dá)區(qū)域，可以推測(cè)，內(nèi)毛細(xì)胞存在CME過程，且這一過程在內(nèi)毛細(xì)胞頂部更加高效、迅速，內(nèi)毛細(xì)胞這一特點(diǎn)在某種程度上與極化的上皮細(xì)胞CME相似。內(nèi)毛細(xì)胞頂部表皮板及附近局部胞質(zhì)可能是胞外物質(zhì)通過CME入胞的重要始發(fā)部位。
　　2)此外，生后早期，隨著年齡的增長(zhǎng)及聽功能的逐漸發(fā)育成熟，Myosin6和Dab2蛋白表達(dá)呈增加的趨勢(shì);同時(shí)老年鼠聽力損失可能與Myosin6蛋白表達(dá)下降有關(guān)