人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導分化內(nèi)耳毛細胞樣細胞的實驗研究.pdf

1、內(nèi)耳毛細胞對于維持聽覺及平衡功能至關(guān)重要。但內(nèi)耳細胞結(jié)構(gòu)易受外傷、藥物毒性、感染、遺傳缺陷、年齡老化等多種因素的破壞，使毛細胞損傷，導致聽覺及前庭功能障礙。目前人工耳蝸植入是這種重度感音神經(jīng)性聾唯一可靠治療方法，而相關(guān)研究表明通過干細胞替代耳蝸毛細胞也具有治療感音神經(jīng)性聾的可能性。前期研究指出，干細胞是一類具有未分化、全能或多能、并且具有能自我更新能力的細胞，其在適當?shù)陌麅?nèi)基因調(diào)控，胞間聯(lián)系及環(huán)境因素下具有分化為體內(nèi)任何一種類型細胞的能

2、力。脂肪來源的間充質(zhì)干細胞(AD—MSCs)在體外經(jīng)誘導，能分化出類似神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，且具有類神經(jīng)細胞的功能。本研究探討通過利用人脂肪源性間充質(zhì)干細胞(human adipose—derived mesenchymal stem cells，hAD—MSCs)體外定向誘導向耳蝸毛細胞方向分化，為干細胞耳蝸內(nèi)移植治療感音神經(jīng)性聾提供新的細胞來源；并將人脂肪源性間充質(zhì)干細胞移植入致聾小鼠耳蝸內(nèi)，觀察移植細胞的體內(nèi)存活及移行轉(zhuǎn)化情況。

3、 目的: 1、在體外驗證將人脂肪源性間充質(zhì)干細胞(human adipose—derived mesenchymal stem cells，hAD—MSCs)定向分化為耳蝸毛細胞的可行性。 2、建立小鼠藥物性耳聾模型；探討耳蝸細胞移植途徑；驗證人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞移植入藥物致聾后的小鼠耳蝸內(nèi)的存活，定植及分化結(jié)果。 方法: 1、分離并培養(yǎng)擴增人脂肪來源的MSCs，流式細胞儀進行細胞表型分析，及細

4、胞周期分析。 2、用特定的培養(yǎng)體系配合多種細胞因子定向誘導hAD—MSCs向神經(jīng)祖細胞樣細胞分化，培養(yǎng)后細胞進行免疫組化鑒定。 3、將誘導后細胞與發(fā)育期雞胚聽泡細胞在體外進行共培養(yǎng)，以促使其向內(nèi)耳毛細胞分化，通過免疫組化等方法對分化不同階段的細胞特異性指標進行鑒定。 4、聯(lián)合應(yīng)用硫酸卡那霉素及呋塞米快速制備藥物性聾小鼠動物模型 5、經(jīng)外半規(guī)管途徑及靜脈途徑向藥物性耳聾小鼠耳蝸內(nèi)移植入hAD—MSCs，通過

5、組織免疫熒光及逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測植入細胞的轉(zhuǎn)化情況。 結(jié)果: 1、體外hAD—MSCs誘導后呈現(xiàn)神經(jīng)干祖細胞樣的形態(tài)并表達其特異性標志Nestin， 2、體外hAD—MSCs經(jīng)誘導再與發(fā)育期雞胚聽泡細胞共培養(yǎng)后表達內(nèi)耳毛細胞特異性標志Mathl和MyosinⅦa。 3、人脂肪來源的間充質(zhì)干細胞移植入藥物致聾后的小鼠耳蝸內(nèi)，觀察到移植細胞能夠在耳蝸內(nèi)至少存活2周，耳蝸Rosentha

6、l's管及耳蝸感覺上皮可見少量植入細胞，耳蝸Corti器區(qū)植入細胞表達耳蝸毛細胞特異性抗體MyosinⅦa。小鼠耳蝸提取總cDNA，進行RT-PCR檢測可見耳蝸有人特異性看家基因beta—actin及少量Math—1表達。 結(jié)論: 1、hAD—MSCs在體外可定向誘導分化為具有內(nèi)耳毛細胞特異性標志的內(nèi)耳毛細胞樣細胞。 2、hAD—MSCs移植入藥物性聾小鼠耳蝸內(nèi)能夠存活，移行定植于Rosenthal's管及耳蝸感