人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、內(nèi)耳毛細(xì)胞對(duì)于維持聽(tīng)覺(jué)及平衡功能至關(guān)重要。但內(nèi)耳細(xì)胞結(jié)構(gòu)易受外傷、藥物毒性、感染、遺傳缺陷、年齡老化等多種因素的破壞，使毛細(xì)胞損傷，導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)及前庭功能障礙。目前人工耳蝸植入是這種重度感音神經(jīng)性聾唯一可靠治療方法，而相關(guān)研究表明通過(guò)干細(xì)胞替代耳蝸毛細(xì)胞也具有治療感音神經(jīng)性聾的可能性。前期研究指出，干細(xì)胞是一類具有未分化、全能或多能、并且具有能自我更新能力的細(xì)胞，其在適當(dāng)?shù)陌麅?nèi)基因調(diào)控，胞間聯(lián)系及環(huán)境因素下具有分化為體內(nèi)任何一種類型細(xì)胞的能

2、力。脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(AD—MSCs)在體外經(jīng)誘導(dǎo)，能分化出類似神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且具有類神經(jīng)細(xì)胞的功能。本研究探討通過(guò)利用人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose—derived mesenchymal stem cells，hAD—MSCs)體外定向誘導(dǎo)向耳蝸毛細(xì)胞方向分化，為干細(xì)胞耳蝸內(nèi)移植治療感音神經(jīng)性聾提供新的細(xì)胞來(lái)源；并將人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞移植入致聾小鼠耳蝸內(nèi)，觀察移植細(xì)胞的體內(nèi)存活及移行轉(zhuǎn)化情況。

3、 目的: 1、在體外驗(yàn)證將人脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose—derived mesenchymal stem cells，hAD—MSCs)定向分化為耳蝸毛細(xì)胞的可行性。 2、建立小鼠藥物性耳聾模型；探討耳蝸細(xì)胞移植途徑；驗(yàn)證人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植入藥物致聾后的小鼠耳蝸內(nèi)的存活，定植及分化結(jié)果。 方法: 1、分離并培養(yǎng)擴(kuò)增人脂肪來(lái)源的MSCs，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型分析，及細(xì)

4、胞周期分析。 2、用特定的培養(yǎng)體系配合多種細(xì)胞因子定向誘導(dǎo)hAD—MSCs向神經(jīng)祖細(xì)胞樣細(xì)胞分化，培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定。 3、將誘導(dǎo)后細(xì)胞與發(fā)育期雞胚聽(tīng)泡細(xì)胞在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，以促使其向內(nèi)耳毛細(xì)胞分化，通過(guò)免疫組化等方法對(duì)分化不同階段的細(xì)胞特異性指標(biāo)進(jìn)行鑒定。 4、聯(lián)合應(yīng)用硫酸卡那霉素及呋塞米快速制備藥物性聾小鼠動(dòng)物模型 5、經(jīng)外半規(guī)管途徑及靜脈途徑向藥物性耳聾小鼠耳蝸內(nèi)移植入hAD—MSCs，通過(guò)

5、組織免疫熒光及逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)植入細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況。 結(jié)果: 1、體外hAD—MSCs誘導(dǎo)后呈現(xiàn)神經(jīng)干祖細(xì)胞樣的形態(tài)并表達(dá)其特異性標(biāo)志Nestin， 2、體外hAD—MSCs經(jīng)誘導(dǎo)再與發(fā)育期雞胚聽(tīng)泡細(xì)胞共培養(yǎng)后表達(dá)內(nèi)耳毛細(xì)胞特異性標(biāo)志Mathl和MyosinⅦa。 3、人脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植入藥物致聾后的小鼠耳蝸內(nèi)，觀察到移植細(xì)胞能夠在耳蝸內(nèi)至少存活2周，耳蝸Rosentha

6、l's管及耳蝸感覺(jué)上皮可見(jiàn)少量植入細(xì)胞，耳蝸Corti器區(qū)植入細(xì)胞表達(dá)耳蝸毛細(xì)胞特異性抗體MyosinⅦa。小鼠耳蝸提取總cDNA，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)可見(jiàn)耳蝸有人特異性看家基因beta—actin及少量Math—1表達(dá)。 結(jié)論: 1、hAD—MSCs在體外可定向誘導(dǎo)分化為具有內(nèi)耳毛細(xì)胞特異性標(biāo)志的內(nèi)耳毛細(xì)胞樣細(xì)胞。 2、hAD—MSCs移植入藥物性聾小鼠耳蝸內(nèi)能夠存活，移行定植于Rosenthal's管及耳蝸感