CD137在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)及功能研究.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelialcell，EC)的免疫功能日益受到重視，內(nèi)皮細(xì)胞除了保證血管壁結(jié)構(gòu)與功能完整，激活后還可表達(dá)或上調(diào)表達(dá)多種免疫功能相關(guān)分子，既可作為細(xì)胞因子、炎性因子作用的靶細(xì)胞，又能分泌細(xì)胞因子等活性介質(zhì)，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程中有重要作用。它具有多種免疫功能，與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。 EC以MHC-Ⅱ類分子限制性方式將抗原肽呈遞給淋巴細(xì)胞，并可通過B7/CD28、CD40/CD40L、

2、CD58(LFA-3)/CD2(LFA-2)等途徑向淋巴細(xì)胞提供共刺激信號，促進(jìn)免疫應(yīng)答的進(jìn)程。EC上表達(dá)的共刺激分子(LFA-3、CD40L、PDL-1、PDL-2、ICOSL、OX40L)和T細(xì)胞上表達(dá)的相應(yīng)的受體結(jié)合后，一方面可以作用于EC而促使其活化和分泌細(xì)胞因子，另一方面又可以影響CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞活化和功能，從而參與特異性免疫應(yīng)答的調(diào)控以及增強(qiáng)細(xì)胞因子的分泌。所以，共刺激分子在EC與T細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮

3、著重要的作用。 研究發(fā)現(xiàn)，共刺激分子在免疫應(yīng)答的不同階段介導(dǎo)免疫應(yīng)答的啟動、激發(fā)、擴(kuò)大和增強(qiáng)作用以及效應(yīng)介導(dǎo)，而且通過負(fù)性共刺激分子可精確地調(diào)節(jié)應(yīng)答的程度和持續(xù)的時間。效應(yīng)性CD8+和CD4+T細(xì)胞的維持和功能，以及記憶性T細(xì)胞發(fā)生再次應(yīng)答不依賴B7-1/B7-2-CD28/CTLA-4和CD40-CD40L共刺激信號通路，針對調(diào)節(jié)記憶和效應(yīng)性T細(xì)胞的功能達(dá)到維持外周耐受應(yīng)選擇ICOS-B7RP-1和PD-1-PD-L1/PD-

4、L2信號通路，但是，有時ICOS-B7RP-1或PD-1-PD-L1/PD-L2信號通路不能完全抑制CD8+T細(xì)胞的功能，而CD137在調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的功能方面有著重要的作用。 我們初步研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞在未活化時有較低的CD137蛋白表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞活化后CD137的表達(dá)上調(diào)。CD137是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族的成員之一，它表達(dá)于活化的T細(xì)胞表面，介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號能促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖、分化，也能誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。

5、CD137既能協(xié)同CD28對T細(xì)胞的共刺激作用，也能不依賴于CD28而發(fā)揮共刺激效應(yīng)。另外，CD137也表達(dá)于DC和單核細(xì)胞，并促進(jìn)DC和單核細(xì)胞活化及分泌細(xì)胞因子。所以，我們設(shè)想CD137在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)可能同樣具有促其擴(kuò)增及分泌的功能。 內(nèi)皮細(xì)胞表面的CD137分子可能作為膜受體，當(dāng)與相應(yīng)的配體或抗體相互作用時，可介導(dǎo)細(xì)胞活化信號，促進(jìn)其細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌，參與炎癥和免疫調(diào)節(jié)。由于CD137配體(CD137L)可以在活化的

6、T細(xì)胞上表達(dá)，未活化或被LPS或其它介質(zhì)活化后的內(nèi)皮細(xì)胞，是否可以通過CD137/CD137L介導(dǎo)其與T細(xì)胞間的作用，從而對T細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，這是我們需要進(jìn)一步深入研究的問題。國內(nèi)外均未見報(bào)導(dǎo)。為此，我們對CD137內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)和功能以及在內(nèi)皮細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用中的意義進(jìn)行了初步研究。本文研究的主要內(nèi)容及結(jié)果包括： 1.成功的建立了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)分離、培養(yǎng)的細(xì)胞模型，獲得了傳代穩(wěn)定，具有足

7、夠純度和數(shù)量的原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞模型，保證了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利實(shí)施。 2.采用RT-PCR、及流式細(xì)胞分析技術(shù)，較全面地研究了未刺激和不同細(xì)胞因子束激(TNF-α(25ng/ml)、LPS(100ng/ml)、IFN-γ(1000U/ml)、IL-1β(10ng/ml)、IL-1β+IFN-γ)活化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上CD137分子的表達(dá)情況。并在24、48、48-72不同時間點(diǎn)檢測了CD137分子的表達(dá)情況。從mRNA和蛋白水平證實(shí)

8、HUVEC能組成性表達(dá)CD137分子，用IL-1β+IFN-γ協(xié)同刺激48-72h后，CD137分子表達(dá)明顯升高，但是CD137L分子無論刺激與否都不表達(dá)。 3.應(yīng)用激發(fā)型anti-CD137單克隆抗體交聯(lián)內(nèi)皮細(xì)胞上的CD137分子，CD137和抗體交聯(lián)后向細(xì)胞內(nèi)傳遞活化信號，成功地刺激了內(nèi)皮細(xì)胞的活化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞因子IL-1、IL-8及粘附分子ICAM-1。說明CD137向內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)傳遞活化信號，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞活

9、化。 4.應(yīng)用PHA和IL-2協(xié)同刺激T細(xì)胞，誘導(dǎo)了T細(xì)胞活化，驗(yàn)證了CD137L在活化T細(xì)胞表面的表達(dá)，為下一步的功能研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用共培養(yǎng)技術(shù)，模擬體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用，首次應(yīng)用活化的T細(xì)胞刺激了內(nèi)皮細(xì)胞活化，誘導(dǎo)了內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞因子IL-1、IL-8以及粘附分子ICAM-1的表達(dá)。當(dāng)應(yīng)用可溶性融合蛋白CD137-Fc阻斷后，內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞因子的能力降低。說明CD137-Fc成功地阻斷了CD

10、137/CD137L的相互作用，證明活化的T細(xì)胞通過表達(dá)的CD137L結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的CD137，刺激了內(nèi)皮細(xì)胞的活化。 5.采用細(xì)胞共培養(yǎng)，首次證明了活化的內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)CD137蛋白分子與活化的T細(xì)胞上誘導(dǎo)表達(dá)的CD137L相互作用，通過CD137L向T細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制信號，抑制了T細(xì)胞合成和分泌細(xì)胞因子的功能，T細(xì)胞分泌IL-2、IL-10和IFN-γ的水平下降。應(yīng)用anti-CD137單克隆抗體阻斷CD137/CD1

11、37L相互作用后，阻斷了CD137L介導(dǎo)的抑制作用，IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌水平升高。同時，應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測共培養(yǎng)后的T細(xì)胞的存活率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，T細(xì)胞的存活率下降，說明CD137L反向信號傳導(dǎo)介導(dǎo)了凋亡信號，表明CD137/CD137L信號通路在內(nèi)皮細(xì)胞與T細(xì)胞的信號作用中有著重要的地位。 綜上，本研究在證實(shí)CD137分子在內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)以及活化T細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)CD137L的基礎(chǔ)上，首次應(yīng)用