快速老化APP-PS1阿爾茨海默病小鼠模型的建立及氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)AD三轉(zhuǎn)基因小鼠D421位點tau切割的研究.pdf

1、第一部分快速老化APP/PS1阿爾茨海默病小鼠模型的建立
　　阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與年齡密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其特點是記憶逐漸和永久性喪失。AD的病理遺傳原因主要是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)和早老素1(presenilin1，PS1)的基因突變。通過對AD病理的逐步加深認知，研究人員模擬相關(guān)病理為基礎(chǔ)，建立不同的APP轉(zhuǎn)基因模型以研

2、究β-淀粉樣蛋白(beta amyloid，Aβ)斑塊與AD發(fā)病的相互關(guān)系。目前，表達嵌合小鼠/人APP和突變型人PS1的APP/PS1模型小鼠已被廣泛應(yīng)用于老年癡呆癥相關(guān)的研究。盡管該模型小鼠腦內(nèi)會出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白及認知功能障礙，但這些改變大都發(fā)生在小鼠生命后期。鑒于現(xiàn)今APP/PS1小鼠病理改變及認知功能出現(xiàn)較遲，因此我們建立了一種以快速老化(senescence accelerated mouse，SAMP8)為背景的APP/P

3、S1小鼠，通過結(jié)合老化因素及AD相關(guān)基因，該模型能更全面的模擬AD的病理及行為學(xué)改變的小鼠模型。
　　為了驗證該模型的行為及病理改變，我們給模型小鼠進行了一系列的行為學(xué)及腦病理觀察。采用開場及高架十字迷宮實驗，我們觀察了小鼠的自主活動能力及焦慮水平。為了檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶，我們也對小鼠進行了穿梭箱及morris水迷宮實驗。進一步的尼氏染色，剛果紅染色及Aβ免疫組織化學(xué)法觀察了小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元病變及淀粉樣蛋白沉積。最后，采用超氧化物歧

4、化酶，過氧化氫酶，谷胱甘肽還原酶及丙二醛試劑盒，我們也分別測定小鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。
　　開場及高架十字迷宮實驗結(jié)果顯示9月齡SAMP8 APP/PS1小鼠表現(xiàn)過度活躍及處于低焦慮狀態(tài)。穿梭箱分析結(jié)果表明，9月齡 SAMP8 APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)障礙。Morris水迷宮實驗結(jié)果也顯示9月SAMP8 APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受到損害。進一步的形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，與同齡正常對照小鼠比較，9月齡SAMP8 APP/PS

5、1小鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)出現(xiàn)較嚴重的神經(jīng)元丟失。剛果紅染色顯示，大量的淀粉樣變性出現(xiàn)在9月齡的SAMP8 APP/PS1小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)中。Aβ免疫組化檢測結(jié)果顯示，SAMP8 APP/PS1小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)Aβ免疫陽性反應(yīng)始于6月齡，隨著老化加重，更多的Aβ出現(xiàn)在SAMP8 APP/PS1小鼠腦中。結(jié)果也顯示SAMP8 APP/PS1小鼠腦內(nèi)超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，谷胱甘肽還原酶活性明顯較低，而脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛則明顯升高，說明該小鼠腦

6、內(nèi)氧化水平升高。
　　通過行為學(xué)及病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)SAMP8 APP/PS1小鼠能較好的模擬AD的病理改變，包括腦內(nèi)較多神經(jīng)元丟失、淀粉樣蛋白沉積和較高的氧化水平。SAMP8 APP/PS1小鼠也出現(xiàn)了較嚴重的行為學(xué)異常，如自主活動增加，低焦慮及學(xué)習(xí)認知功能的缺失。
　　本實驗結(jié)果表明，快速老化 SAMP8和APP/PS1突變的結(jié)合加劇了新型AD模型SAMP8 APP/PS1小鼠的AD病理及行為改變，相比之下傳統(tǒng)的C57 A

7、PP/PS1及SAMP8模型小鼠的病理及異常行為改變明顯較少。因此，SAMP8 APP/PS1為AD的研究提供一個更理想的動物模型。
　　第二部分氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)AD三轉(zhuǎn)基因小鼠D421位點tau切割的研究
　　Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，異常修飾的tau蛋白則是神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)的主要組成成分。NFTs被證實為AD的主要病理生理學(xué)特征之一，也是導(dǎo)致神經(jīng)元變性的重要因素之

8、一。研究表明，具有神經(jīng)毒性的tau蛋白可能不是成熟的NFTs而是以pretangle形式存在的修飾后tau蛋白，其中tau于D421(Asp421)位點的切割與AD的病理進程相關(guān)。越來越多的實驗表明，由半胱氨酸蛋白酶(caspase)誘導(dǎo)，在D421位點切割的tau是AD主要病理原因之一。
　　研究證實小鼠腦內(nèi)tau蛋白在D421位點的切割與活化的caspase和纖維狀的tau是共定位的。研究也表明活性氧水平升高是AD發(fā)生的一個早

9、期因素，活性氧水平升高促進小鼠腦內(nèi)D421位點tau切割；而體外實驗中氧化應(yīng)激提高則可引起細胞caspase6活性增強。相關(guān)AD研究也發(fā)現(xiàn)，caspase的激活優(yōu)先于tau蛋白于D421位點的切割，推斷 tau蛋白D421的切割可能AD發(fā)病中早期的重要過程。因此我們的假說認為氧化應(yīng)激可能通過激活caspase6催化D421位點tau切割參與AD病人腦內(nèi)NFTs的形成。
　　為了驗證以上假說，我們分別給予了APP/PS1/tau A

10、D模型小鼠氧化劑及抗氧化劑的處理。通過水迷宮實驗，尼氏染色，剛果紅染色及氧化應(yīng)激相關(guān)指標檢測（超氧化物歧化酶，過氧化氫酶，谷胱甘肽還原酶及丙二醛測試），我們檢測了氧化及抗氧化對該小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)元，淀粉樣蛋白及氧化應(yīng)激水平的影響。除此之外，我們也采用免疫印跡法檢測caspase6蛋白及tau蛋白于D421位點的切割情況，最后通過免疫組織化學(xué)及共聚焦顯微鏡觀察以確定氧化應(yīng)激的升高是否誘導(dǎo)caspase6與tau蛋白于D421位點切割。

11、>　　水迷宮實驗結(jié)果顯示氧化應(yīng)激組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力降低。尼氏染色觀察小鼠神經(jīng)元結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激組小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。剛果紅染色及Aβ免疫組化結(jié)果也顯示，與模型及抗氧化劑處理小鼠比較，較多的淀粉樣蛋白沉積在氧化應(yīng)激組小鼠腦內(nèi)的皮質(zhì)及海馬區(qū)。氧化水平相關(guān)酶的檢測結(jié)果顯示氧化應(yīng)激小鼠腦內(nèi)的相關(guān)過氧化酶-超氧化物歧化酶，過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化酶明顯降低，而脂質(zhì)氧化水平則明顯升高。免疫印跡結(jié)果表明，氧化應(yīng)激小鼠腦內(nèi)caspase

12、6明顯升高；tau C3的表達水平也明顯提高，這提示caspase6的激活誘導(dǎo)了tau蛋白于D421位點的切割。進一步的免疫熒光共定位結(jié)果顯示caspase6表達區(qū)域出現(xiàn)了tau C3的共定位，再次證明了兩者之間是存在因果關(guān)系的。
　　綜合本實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激能引發(fā)腦內(nèi)一系列的病理改變，同時伴隨著行為學(xué)和認知功能障礙。我們也發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激提高小鼠腦內(nèi)相關(guān)氧化水平，導(dǎo)致caspase6表達升高及D421位點tau切割增加。