中藥PN-1及丙戊酸鈉對APP-PS1轉基因阿爾茨海默病小鼠模型的治療作用及其機制研究.pdf

1、第一部分、中藥PN-1對APP／PS1轉基因阿爾茨海默病小鼠模型認知能力的改善及機制研究
　　 背景：阿爾茨海默?。ˋlzheimer'sdisease，AD）是一種進行性發(fā)展的神經退行性疾病。該病發(fā)病年齡多在65歲以后，平均病程約8～10年，臨床表現為記憶、認知、理解、判斷推理能力以及社會適應能力、個人生活能力慢性進行性減退，最終發(fā)展為嚴重癡呆，常因褥瘡、骨折、肺炎、營養(yǎng)不良等繼發(fā)軀體疾病或衰竭而死亡。據預計，2050年在全球

2、范圍內每85人中將有1人罹患AD。隨著全球人口老齡化程度的加劇，AD患者的日益增加已成為各國主要的保健和社會問題之一。AD的確切病因尚不清楚。但神經病理學研究結果提示該疾病與大腦內老年斑(senileplaque，SP)和神經原纖維纏結（neurofibrillarytangle，NFT）形成有關。可能的機制包括β淀粉樣肽（amyloidbeta，Aβ）沉積、炎癥損傷、氧化應激、自由基損傷等。其中，Aβ級聯假說被認為是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)

3、。該假說認為Aβ聚集是始動因素，Aβ聚集后損傷突觸，激活神經膠質細胞并誘發(fā)炎癥反應，損傷突觸傳遞和神經元功能，最終導致癡呆。目前，美國食品藥物管理局(FDA)批準的5種治療AD的藥物僅限于乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑和NMDA受體拮抗劑，但均不能根治和逆轉病程。因此，探索新的AD治療策略和治療藥物對于降低AD死亡率和減輕社會負擔均具有重要的意義。近年來，隨著學習記憶的分子神經生物學機制研究的進展，神經元突觸結構和功能對于維持正常的認知

4、能力具有重要意義。并且，臨床和動物模型研究均發(fā)現，AD腦內神經突觸結構和功能存在缺陷。因此，本研究將從突觸信號轉導的角度探討APP/PSI轉基因小鼠模型學習記憶缺陷的分子生物學機制，并以改善突觸功能為目的來評估和探討中藥治療AD的療效和機制。
　　 方法：將5月齡的APP/PS1雙轉基因AD小鼠模型隨機分為模型組(Vehicle)、安理申治療組(Aricept,2mg/kg)、中藥PN-1低(0.6g/kg)、中(1.2g/kg

5、)、高(2.4g/kg)劑量組，并以同窩陰性的C57BL/6J小鼠作為正常對照組(WT)，每組20只，雌雄各半。給藥組小鼠每天灌胃給藥1次，同時模型組及正常組小鼠則給予等體積的雙蒸水。給藥前稱量小鼠初始體重、攝食量和飲水量；給藥期間，每兩周逐只稱量體重一次，同時稱量并計算平均攝食量和飲水量。給藥3個月后（8月齡）應用曠場實驗、新物體識別實驗和Morris水迷宮實驗來觀察PN-1對APP/PSI小鼠自主行為和認知功能的改善作用；免疫組織化

6、學和硫磺素．S染色檢測腦內老年斑含量；應用ELISA方法檢測小鼠腦內可溶性和非可溶性Aβ40和Ap42總量；Westernblotting和免疫組織化學方法檢測小鼠腦內可塑性相關蛋白的表達量；檢測腦重、腦系數、血清中丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、肌酐(Cr)等指標的含量以評估PN-1對小鼠神經系統(tǒng)和肝腎功能的影響。
　　 結果：PN-1給藥3個月能夠顯著減少APP/PS1轉基因小鼠在曠場中的活動量，增加新物體識別實驗中的識別指數，

7、減少Morris水迷宮定位航行實驗中小鼠找到平臺的潛伏期，并增加空間探索實驗中小鼠穿越平臺所在象限的次數和停留時間。PN-1給藥4個月能夠顯著減少海馬內可溶性Aβl-40和可溶性Aβl-42濃度；減少APP/PS1小鼠腦皮層和海馬內老年斑的面積、數量和致密度。PN-1給藥4個月能夠增加APP/PS1小鼠腦內突觸結合蛋白(Syt1)、鈣調蛋白(CaM)和腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)的表達，增加磷酸化鈣調激酶Ⅱ(p-caMⅡ，Thr286

8、）、磷酸化鈣調激酶Ⅳ(p-CaMKIV，Thr196+Thr200)和磷酸化環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(p-CREB，Ser133)的相對含量。此外，PN-1給藥3個月對APP/PS1小鼠體重、攝食量和飲水量均無顯著影響；PN-1給藥4個月對APP/PS1小鼠腦重、腦系數和肝腎功能亦無顯著影響。
　　 結論：PN-1顯著減少APP/PS1轉基因小鼠異常增高的興奮性和異常增多的活動量、改善小鼠認知功能；減少腦內Aβ水平和淀粉樣多肽沉

9、積；增加腦內突觸可塑性相關信號轉導蛋白的表達水平。同時，該藥未見對小鼠代謝、神經系統(tǒng)和肝腎功能有明顯毒性作用。
　　 第二部分、丙戊酸鈉(VPA)對APP／PS1雙轉基因阿爾茨海默病小鼠模型認知功能的作用及機制初探
　　 背景：表觀遺傳學主要研究DNA序列未發(fā)生變化、可遺傳的基因表達改變。近幾年來，人們發(fā)現表觀遺傳修飾參與了大腦的學習和記憶過程。表觀遺傳作用通過DNA甲基化、組蛋白修飾等調控方式來實現對基因表達的控制。其

10、中，由組蛋白去乙?；?HDACs)介導的組蛋白修飾與學習和記憶的關系研究較為充分。HDACs是一個大的去乙酰化酶家族，其成員目前已知有18個不同的亞型，按蛋白同源性分為4大類：HDACI類（包括HDACI，2,3，8）、HDACⅡA類(包括HDAC4,5，7，9)、HDACⅡB類（包括HDAC6，10）、HDACⅢ類（包括SRIT1～7）和HDACⅣ類(HDAC11)。并且，研究發(fā)現，Ⅰ類中的HDAC2在海馬神經突觸結構和功能可塑性方

11、面起著重要的負調控作用。因此，研究和開發(fā)HDAC抑制劑對于以認知障礙為主要表現的神經退行性疾病具有重要的治療意義。
　　 方法：5月齡APP/PS1雙轉基因AD模型小鼠隨機分為模型組(Vehicle)、丙戊酸鈉(VPA，100mg/kg)組，并以同窩陰性的C57BL/6J小鼠作為正常對照組(WT)，每組20只，雌雄各半。給藥組小鼠每天腹腔注射給藥1次，同時模型組及正常組小鼠給予等體積的生理鹽水。給藥3個月后（8月齡）應用曠場實驗

12、和Morris水迷宮實驗觀察VPA對APP/PS1小鼠自主行為和認知功能的改善作用；Westernblotting和免疫組化方法檢測小鼠海馬H3和H4表達量及其乙?；健DAC2、突觸可塑性相關蛋白表達量；HDACs總活性檢測試劑盒檢測HDACs和HDAC2活性。
　　 結果：VPA給藥3個月后，APP/PSI轉基因小鼠在曠場中的興奮性和自主活動量較模型組小鼠顯著減少，Morris水迷宮隱藏平臺實驗中小鼠找到平臺的潛伏期顯著

13、縮短，并且空間探索實驗中小鼠穿越平臺所在象限的次數和滯留時間明顯增加。VPA給藥4個月后，小鼠海馬組蛋白H3、H4表達量與模型組小鼠相比無顯著變化，但乙酰化組蛋白H3(K9)、H4(K8)水平顯著升高。此外，各組間HDAC2表達量并無顯著性差異，但VPA給藥后海馬HDACs和HDAC2的活性顯著降低、小鼠海馬NR2B、CaM表達量較模型組顯著增加，并且磷酸化CaMn(Tyr286)和磷酸化CREB(Ser133)水平也明顯增加。

14、　　 結論：1）VPA具有情緒穩(wěn)定功能；2）VPA是一種HDACs抑制劑；3)VPA可能通過降低HDACs/HDAC2的活性、促進組蛋白乙?；揎?、增加突觸可塑性相關基因的表達水平來增強轉基因小鼠的學習和記憶功能。
　　 第三部分、成年C57BL／6J小鼠腦HDAC2的表達分布及細胞類型定位
　　 背景：組蛋白乙酰化／去乙?；揎検侨旧|構象動態(tài)變化及轉錄調控的重要機制之一。在組蛋白乙?；D移酶（HATs）的作用下，組

15、蛋白H3或H4特定位點的賴氨酸殘基發(fā)生乙?；磻沟萌旧|結構變得松散、轉錄因子更易于與基因啟動子區(qū)相互結合并促進基因轉錄和表達。相反，乙酰化的組蛋白在組蛋白去乙酰化酶(HDACs)的作用下發(fā)生脫乙?；磻?，誘導染色質固縮和基因表達減少。組蛋白乙?；ヒ阴；揎椩谏窠浖毎纬伞W習和記憶、神經退行性疾病等生理和病理過程中的作用已有較多報道。并且，作為HDACs亞型之一的HDAC2在神經元發(fā)育分化、突觸可塑性、抑郁、肌萎縮性側索硬化癥

16、(ALS)等生理和病理過程中起著重要的調控作用。但目前有關HDAC2在小鼠腦內的表達分布情況報道較少。
　　 方法：應用免疫組化方法檢測HDAC2在成年C57BL/6J小鼠腦內的表達分布情況；應用熒光雙標技術檢測HDAC2與神經元特異性標志物(MAP2)、膽堿能神經元特異性標志物(ChAT)、血清素能神經元特異性標志物(SERT)、兒茶酚胺能神經元特異性標志物(DBH)、谷氨酸能突觸后神經元特異性標志物(NRI)、γ-氨基丁酸能

17、突觸后神經元特異性標志物(GABAARcα1)、少突膠質細胞標志物(MOSP)、星形膠質細胞標志物(GFAP)、小膠質細胞標志物(Iba-1)的共表達情況。
　　 結果：免疫組化結果分析表明，HDAC2主要表達于細胞核內，并在成年C57BL/6J小鼠腦內分布較為廣泛，尤以海馬錐體細胞層、顆粒細胞層、小腦顆粒細胞層、嗅球內叢狀層表達最為豐富；在丘腦和下丘腦的某些亞區(qū)呈輕、中度表達；在中腦、基底節(jié)和腦干的某些亞區(qū)表達較弱。熒光雙標實

18、驗顯示，HDAC2與MAP2存在明顯的共定位現象。進一步的研究發(fā)現，ChAT、SERT、DBH、NR1、GABAARα1陽性染色的細胞內均有HDAC2的表達。在與膠質細胞標志物的共定位研究中發(fā)現，HDAC2與MOSP有明顯的共表達現象，但在GFAP、Iba-1陽性染色的細胞內未見有HDAC2的表達。
　　 結論：HDAC2在成年C57BL/6J小鼠腦內的分布較為廣泛，主要表達于神經元、少突膠質細胞核內，但在星形膠質細胞和小膠質細