紅景天苷和丹酚酸B對人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的作用.pdf

1、背景 外周血、臍帶血和骨髓中存在能分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，參與成體動物的新血管形成的一群功能性前體細(xì)胞，這類細(xì)胞被稱為內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcell)。當(dāng)發(fā)生血管損傷時，內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓釋放入外周血，遷移至受損部位，摻入血管壁中，分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)受損血管，參與血管新生，改善甚至恢復(fù)缺血組織的血供。通過移植含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的骨髓成分或經(jīng)體外擴(kuò)增的內(nèi)皮祖細(xì)胞，可以治療缺血性疾病。外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)

2、量和功能還可用來評估心血管疾病的危險性和預(yù)后，用藥物等干預(yù)手段提高外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能，可能是防治心血管疾病的有效的新方法。不論是為提高自體內(nèi)皮祖細(xì)胞移植的療效，還是探索防治心血管疾病的新方法，研究藥物增加在體或離體內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量、提高其功能都具有重要的意義。 中藥紅景天及其有效成分紅景天苷和丹參及其有效成分丹酚酸B對心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，它們有可能對內(nèi)皮祖細(xì)胞也有調(diào)控作用。 目的 觀察紅景天苷和丹酚酸

3、B對體外培養(yǎng)的人內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡的影響。如果確有影響，則進(jìn)一步探討可能的機(jī)制。希望通過本實(shí)驗(yàn)的研究，能夠初步明了紅景天苷和丹酚酸B對體外培養(yǎng)的人內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響，為今后研究更多中藥及中藥組分對內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響打下基礎(chǔ)。以這些研究為基礎(chǔ)，有望研制開發(fā)一些具有臨床應(yīng)用價值的藥物，將骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞動員到受損部位，為防治心血管疾病提供一種新的策略。 方法 1，紅景天甙類與丹酚酸B對大鼠心肌梗死模型的血管新生作用

4、 3月齡雄性SD大鼠，結(jié)扎左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型。隨機(jī)分為7組，每組10只，分別為紅景天甙類大劑量組(10g·kg-1)；中劑量組(5g·kg-1)；小劑量組(2．5g·kg-1)；丹酚酸B(1g·kg-1)；西藥對照組舒降之：(3．3mg·kg-1)；假手術(shù)組(生理鹽水)；模型組(生理鹽水)；每日灌胃一次，共14天。14天后處死取材。 梗死面積檢測：垂直于左室長軸切取O．3cm厚的含梗死區(qū)的左心室，常規(guī)固定，石臘包

5、埋，沿長軸面切片(4μm厚)，蘇木精—伊紅(HE)染色，IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)、醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測量相同心室面積中心肌梗死面積。 心肌CD34表達(dá)量檢測：常規(guī)免疫組化染色，IMS細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)、醫(yī)學(xué)圖像分析軟件，對包括梗死區(qū)和梗死周圍區(qū)心肌CD34的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。 2，人內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 采用Ficoll密度梯度離心的方法，分離健康志愿者外周血中的單個核細(xì)胞，以每孔1．5*106個細(xì)胞的密度，

6、800ml內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)基的體積種植于預(yù)先包被Fibronectin的24孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)至第四天，換液，吸去懸浮細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)至第七天，對貼壁細(xì)胞作Dil-acLDL與FITC—UEA-1Lectin雙標(biāo)記，以鑒定是否為內(nèi)皮祖細(xì)胞。用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面CD34與VEGF-receptor2的表達(dá)情況。對培養(yǎng)至第七天的細(xì)胞，用O．25％胰蛋白酶消化傳代，以每孔3*104個細(xì)胞的密度，100μl培養(yǎng)基的體積種植于預(yù)先包被過Fibron

7、ectin的96孔板中。 3，紅景天苷與丹酚酸B對人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響 采用XTT比色法檢測細(xì)胞增殖情況。首先根據(jù)XTT作用時間與XTT檢測的OD值之間的關(guān)系確定XTT最適反應(yīng)時間，然后根據(jù)細(xì)胞密度與XTT檢測的OD值之間的關(guān)系確定最適細(xì)胞種植密度，再根據(jù)藥物作用時間與XTT檢測的OD值之間的關(guān)系確定最佳藥物作用時間，最后觀察4μg／ml、8μg／ml和16μg／ml的紅景天苷以及5μg／ml、10μg/ml、20μg

8、/ml和100μg/ml丹酚酸B對內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響。 4，紅景天苷與丹酚酸B對人內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移的影響 采用Transwell系統(tǒng)檢測細(xì)胞的遷移。對Transwell小室多孔濾膜的上、下面均包被Fibronectin，0．25％的胰蛋白酶消化培養(yǎng)至第七天的細(xì)胞，以每孔3*104的細(xì)胞密度，100μl體積種植于Transwell小室中。下室中加入內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基600μl，培養(yǎng)24h。在Transwell小室中加入8μg/

9、ml紅景天苷或10μg／ml丹酚酸B，下室中加入VEGF使終濃度為500ng／ml，繼續(xù)培養(yǎng)12h。對Transwell小室多孔濾膜的下面進(jìn)行固定、染色、封片，每張膜由獨(dú)立觀察者在高倍鏡下隨機(jī)選取9個視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取平均值。 5，紅景天苷與丹酚酸B對人內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)分析DNA含量來反應(yīng)細(xì)胞凋亡。以無血清，無細(xì)胞因子的M199培養(yǎng)基來誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡，加入8μg／ml紅景天苷或10μg／ml丹酚酸

10、B培養(yǎng)24h。用1mmol／LEDTA／PBS消化細(xì)胞，以流式細(xì)胞固定液固定細(xì)胞，PI染色，做凋亡細(xì)胞核PI標(biāo)記后的流式細(xì)胞術(shù)分析。 6，紅景天苷與丹酚酸B促人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖機(jī)制的初步探討 應(yīng)用PI3K特異性抑制劑LY294002和Wortmannin以及MEKl特異性抑制劑PD98059觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖情況。分組：對照組不加任何藥物；8μg／ml紅景天苷組；紅景天苷+10μMLY294002組；紅景天苷+10μMW

11、ortmannin組；紅景天苷+10μMPD98059組；10μg／ml丹酚酸B組：丹酚酸B+10μMLY294002組；丹酚酸B+10μMWortmannin組；丹酚酸B+10μMPD98059組。作用24h，檢測XTT光密度值。 結(jié)果 1，紅景天甙類與丹酚酸B對大鼠心肌梗死模型的血管新生作用 紅景天甙類各劑量組、丹酚酸B能減少梗死面積，各P值均<0．01。甙類大劑量組、丹酚酸B組與西藥對照組舒降之的療效一致，

12、各P值均>0．05。甙類各劑量組之間比較，大劑量組的療效優(yōu)于小劑量組，P<0．01，與中劑量組無差別，P>0．05。對紅景天甙類來說，雖無典型的劑量效應(yīng)關(guān)系，但仍以大劑量為佳。 紅景天甙類各劑量組與丹酚酸B均能提高CD34表達(dá)量，各值均<0．05或0．01；表明紅景天甙類和丹酚酸B對心肌梗死后的血管新生有促進(jìn)作用，且療效與舒降之一致；這幾組成分之間互相比較，療效無差異，各P值均>0．05。 2，人內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與

13、鑒定 用密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞，在體外培養(yǎng)七天，貼壁細(xì)胞呈梭形，能同時攝取Dil-acLDL與結(jié)合FITC-UEA-1Lectin，具有內(nèi)皮細(xì)胞特征。部分細(xì)胞表達(dá)CD34和VEGFR。傳代后的細(xì)胞出現(xiàn)柵欄樣排列。 3，紅景天苷與丹酚酸B對人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖的影響 不同工作濃度(4μg／ml、8μg/ml和16μg/ml)的紅景天苷對體外培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞都有促進(jìn)增殖的作用，P<0．01，沒有劑量效應(yīng)關(guān)系

14、，P>0．05。10μg／ml、20μg/ml的丹酚酸B對內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，P<0．01，10μg／ml比20μg/ml的效果更好，P<0．05；5μg/ml的濃度對內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖無影響，P>0．05；100μg／ml的濃度對內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出抑制作用，P

15、的膜的下面，呈梭形、長條形或多角形，排列無規(guī)則。紅景天苷和丹酚酸B對內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移有促進(jìn)作用，P<0．05；而紅景天苷和丹酚酸B在促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移方面的作用相同，P>0．05。 5，紅景天苷與丹酚酸B對人內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響 用無血清、無VEGF、bFGF、IGF-1、EGF等細(xì)胞因子的營養(yǎng)的培養(yǎng)條件下，未加藥物的對照組內(nèi)皮祖細(xì)胞細(xì)胞凋亡率較高，而紅景天苷能夠減少細(xì)胞凋亡的百分比，P<0.01；丹酚酸B也能減少細(xì)胞凋

16、亡，P<0.05。紅景天苷和丹酚酸B對內(nèi)皮祖細(xì)胞的凋亡有抑制作用，而丹酚酸B的作用弱于紅景天苷，P<0．05。 6，紅景天苷與丹酚酸B促人內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖機(jī)制的初步探討 PI3K抑制劑LY294002和Wortmannin能夠拮抗紅景天苷和丹酚酸B對內(nèi)皮祖細(xì)胞的促增殖作用，P<0．01；Wortmannin的拮抗作用使內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖降低到對照組水平，P>0．05：LY294002甚至低于對照組水平，P<0．01。MAPK

17、抑制劑PD98059同樣能夠拮抗紅景天苷和丹酚酸B對內(nèi)皮祖細(xì)胞的促增殖作用，P<0．05；這種拮抗作用使內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖也降低到對照組水平，P>0．05。本實(shí)驗(yàn)說明，紅景天苷和丹酚酸B對內(nèi)皮祖細(xì)胞的促增殖作用，可能通過PI3K和MAPK兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)。 結(jié)論 紅景天苷和丹酚酸B對體外培養(yǎng)的人內(nèi)皮祖細(xì)胞有促增殖、促遷移和抗凋亡作用，其促增殖作用可能通過PI3K和MAPK兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)。紅景天甙類和丹酚酸B對心肌