重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響.pdf

1、背景： 1971年Folkman提出了腫瘤生長(zhǎng)依賴(lài)于新生血管生成的理論，他認(rèn)為腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移與腫瘤血管生成密切相關(guān)。抑制腫瘤血管生成可能是一種治療腫瘤的新方法。他的理論引起了人們的廣泛關(guān)注。以腫瘤血管生成為靶點(diǎn)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，成為近年來(lái)抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。 正常生理狀況下，血管生成是在促血管生成因子和抑血管生成因子嚴(yán)格調(diào)控下進(jìn)行的，而腫瘤發(fā)生時(shí)，腫瘤細(xì)胞分泌大量促血管生成因子，血管內(nèi)皮細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的刺激下活化，分

2、泌蛋白酶降解基底膜，并向腫瘤細(xì)胞遷移，血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖，形成新的毛細(xì)血管管腔結(jié)構(gòu)，進(jìn)而募集周?chē)?xì)胞，穩(wěn)定新形成的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，最終形成成熟的血管。 目前抗腫瘤血管生成主要針對(duì)以下幾個(gè)方面進(jìn)行研究：增強(qiáng)血管生成抑制因子的作用；抑制或阻斷促血管生成因子的作用；抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移；抑制基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解；抑制特異性粘附分子作用等。 與傳統(tǒng)細(xì)胞毒類(lèi)藥物相比血管生成抑制劑具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)抗血管生成治療對(duì)正常內(nèi)

3、皮細(xì)胞影響不大，具有良好的特異性；(2)血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露在血液中，藥物能夠直接發(fā)揮作用，無(wú)需滲透；(3)采用血管生成抑制劑治療癌癥不易產(chǎn)生耐藥；(4)作用具有放大效應(yīng)，一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞可支持50-100個(gè)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；(5)具有廣譜性，血管生成抑制劑可能對(duì)幾乎所有種類(lèi)的腫瘤有一定的治療效果。 海洋生物物種及其所含物質(zhì)的多樣性使其成為天然藥物的巨大資源寶庫(kù)，具有極大的開(kāi)發(fā)潛力。FAT-03是本實(shí)驗(yàn)室從海洋生物中分離純化的一種強(qiáng)血管生成

4、抑制劑，具有顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移作用。重組FAT-03是本室采用DNA重組克隆技術(shù)生產(chǎn)的。本研究旨在檢測(cè)重組FAT-03的抗血管生成作用。 目的： 1.檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。 2.檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。 3.檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞周期和的影響。 4.檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。 5.檢測(cè)重組F

5、AT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-2、Bax及VEGF蛋白表達(dá)的影響。 方法： 1.MTT法檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。 2.AO/EB、Hochest/PI雙染法檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞周期和凋亡的影響。 4.Transwell小室法檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。

6、5.Western blotting法檢測(cè)重組FAT-03對(duì)人臍靜脈皮細(xì)胞內(nèi)：Bcl-2、Bax及VEGF蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1.終濃度分別為0.05、0.10和0.20mg/ml的重組FAT-03作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24、48和72h，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別為：4.7％、18.0％和63.7％；24.4％、26.6％和69.4％：33.2％、52.4％和87.1％；中、高劑量組的抑制率高于陽(yáng)性對(duì)照恩度(0.20

7、mg/ml)的9.1％、9.6％和41.1％。 2.重組FAT-03(0.15mg/ml)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 3.終濃度分別為0.05、0.10和0.20mg/ml的重組FAT-03作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h，處于G0/G1期的細(xì)胞比例分別為63.4％、67.5％和75.7％高于對(duì)照組的62.1％，凋亡指數(shù)分別為4.2％、8.5％和10.3％。 4.終濃度分別為0.04、0.08和0.12mg/ml的重組

8、FAT-03作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h，遷移抑制率分別為5.9％、32.6％和57.1％，中、高劑量組的抑制率接近或高于陽(yáng)性對(duì)照恩度(0.12mg/ml)的32.0％。 5.重組FAT-03上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2及VEGF蛋白表達(dá)。 結(jié)論： 1.重組FAT-03顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并與劑量和時(shí)間呈正相關(guān)。其增殖抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照恩度。 2.重組FAT-03誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的

9、凋亡，可能是其抑制細(xì)胞增殖的原因之一。 3.重組FAT-03可將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞阻滯于G0/G1期，誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并與劑量呈正相關(guān)。 4.重組FAT-03抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，并與劑量呈正相關(guān)。其遷移抑制作用強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照恩度。 5.重組FAT-03上調(diào)Bax蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2及VEGF蛋白表達(dá)，并與劑量呈正相關(guān)； 6.重組FAT-03抑制細(xì)胞增殖、遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與其上調(diào)Ba