DZNep對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響.pdf

1、3-deazaneplanocinA(DZNep)是一種組蛋白甲基化酶抑制劑，且已被應(yīng)用于抗腫瘤、抗寄生蟲、抗病毒、抗關(guān)節(jié)炎以及免疫抑制活性等藥理作用[1-3]。據(jù)報(bào)道，DZNep可使腫瘤中沉默的抑癌基因再活化，從而抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散，為治療腫瘤提供了一個(gè)新型的靶點(diǎn)。另外，研究表明DZNep對(duì)于治療肝癌、乳腺癌、髓母細(xì)胞瘤、急性髓系白血病、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌、心腦血管疾病以及艾滋病等均能起到重要作用[4-9]。然而關(guān)于DZ

2、Nep對(duì)食管鱗癌的作用報(bào)道甚少，因此本論文將對(duì)DZNep在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行初步研究。
　　食管鱗癌是我國(guó)較常見的消化道惡性腫瘤，其病發(fā)率和病死率位居全國(guó)惡性腫瘤第四位。一般情況下患者確診時(shí)已為中期或者晚期，且容易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[10,11]。傳統(tǒng)的食管鱗癌治療方法主要包括外科手術(shù)治療、化療以及放療，然而患者的治愈率以及預(yù)后情況并不樂(lè)觀。由于誘發(fā)腫瘤的相關(guān)基因的變化是經(jīng)過(guò)多階段積累而成，因而在食管鱗癌癌變的不同階段均涉及

3、到多個(gè)癌基因的激活以及抑癌基因的失活。因此，尋找治療食管鱗癌的分子靶向藥物，聯(lián)合其他治療手段從而綜合治療食管鱗癌已迫在眉睫。
　　S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteinehydrolase，SAHH)作為甲基化通路中的重要限速酶，可催化體內(nèi)細(xì)胞S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH)水解生成腺苷(adenosine，Ado)和高半胱氨酸(homocysteine，Hc

4、y)，該水解反應(yīng)是S-腺苷高半胱氨酸代謝的唯一途徑，且是一種可逆反應(yīng)。腺苷在一系列酶的催化下可生成cAMP，后者作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，可參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]。同時(shí)，高半胱氨酸通過(guò)一系列催化反應(yīng)，生成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethioine，SAM)，SAM為體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)提供甲基，在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下生成S-腺苷高半胱氨酸，從而完成整個(gè)甲基化循環(huán)?？梢?，SAHH是生物體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的重要調(diào)控者，調(diào)控多種受體分子，例如

5、蛋白、核酸以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子等的甲基化反應(yīng)[13]。EZH2是PRC2家族中的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，主要介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的組蛋白去甲基化，在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)。EZH2通過(guò)催化組蛋白3第27位三甲基化(H3K27me3)修飾而誘導(dǎo)基因沉默[14]，且在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)狀態(tài)方面也起到一定作用。已有證據(jù)表明，DZNep具有抗腫瘤活性，部分源于通過(guò)降低EZH2基因的表達(dá)和催化活性從而導(dǎo)致PRC2受到抑制。
　　本研究擬通過(guò)一定濃度的DZ

6、Nep處理食管鱗癌細(xì)胞系EC9706和Eca109細(xì)胞，并檢測(cè)DZNep處理后細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖、遷移、凋以及粘附能力的變化，進(jìn)而探討DZNep對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的影響。本研究主要分為兩部分，第一部分對(duì)DZNep處理食管鱗癌細(xì)胞的條件進(jìn)行探索和優(yōu)化，第二部分檢測(cè)DZNep處理食管鱗癌細(xì)胞后細(xì)胞周期、增殖、遷移、凋亡以及粘附能力的變化。
　　方法
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　食管鱗癌細(xì)胞EC9706、Eca109均為本實(shí)驗(yàn)室保存

7、。兩株細(xì)胞均在含有10％胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中于37℃，含5％CO2的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2、DZNep處理食管鱗癌細(xì)胞條件的優(yōu)化
　　通過(guò)不同濃度的DZNep處理Eca109細(xì)胞，且處理不同時(shí)間后提取細(xì)胞總蛋白，煮沸使其變性，分別通過(guò)WesternBlot方法以及RT-PCR方法檢測(cè)SAHH、EZH2蛋白以及SAHHmRNA水平的表達(dá)，從而確定DZNep處理食管鱗癌細(xì)胞的最優(yōu)條件。
　

8、　3、DZNep對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期、增殖、遷移、凋亡及粘附因子影響的檢測(cè)
　　DZNep按照最優(yōu)條件處理食管鱗癌細(xì)胞后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DZNep對(duì)EC9706和Eca109的細(xì)胞周期以及凋亡的影響，采用EdU熒光顯微鏡法和CCK-8法檢測(cè)DZNep對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，利用Transwell小室法檢測(cè)DZNep對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響，WesternBlot方法檢測(cè)DZNep對(duì)細(xì)胞粘附因子的影響。
　　結(jié)果
　　1、D

9、ZNep處理食管鱗癌細(xì)胞條件優(yōu)化及其相關(guān)蛋白表達(dá)情況
　　設(shè)置不同濃度DZNep處理Eca109細(xì)胞，分別處理48h和72h，通過(guò)WesternBlot方法檢測(cè)SAHH蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果表明，Eca109細(xì)胞中SAHH的表達(dá)在DZNep濃度為5μmol/L，處理時(shí)間為48h時(shí)已經(jīng)有所降低，細(xì)胞形態(tài)已發(fā)生變化且出現(xiàn)死亡細(xì)胞，因此我們選擇其最適濃度為5μmol/L，最佳處理時(shí)間為48h。通過(guò)WesternBlot以及RT-PCR

10、分別檢測(cè)DZNep處理后EC9706和Eca109細(xì)胞與對(duì)照組中SAHH蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化，結(jié)果顯示SAHH無(wú)論在蛋白水平還是mRNA水平均無(wú)明顯變化(P＞0.05)。此外，WesternBlot檢測(cè)結(jié)果表明，DZNep處理組中EZH2的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　2、DZNep對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期、增殖、遷移、凋亡及粘附因子影響的檢測(cè)
　　采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DZNep處理后食管鱗癌細(xì)胞株EC9706和

11、Eca109細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)處理后的EC9706細(xì)胞周期無(wú)明顯變化（P＞0.05），而Eca109細(xì)胞周期與正常細(xì)胞相比有顯著性差異(P＜0.05)。EdU及CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EC9706和Eca109細(xì)胞DZNep處理組的增值率均明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EC9706和Eca109細(xì)胞DZNep處理組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組（P＜0.05）。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，結(jié)

12、果表明兩株細(xì)胞處理組凋亡率明顯比對(duì)照組高（P＜0.05）。最后WesternBlot檢測(cè)E-cadherin的表達(dá)水平變化，表明EC9706和Eca109細(xì)胞的處理組明顯比對(duì)照組高(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　確定了DZNep處理Eca109細(xì)胞的最適濃度為5μmol/L，最佳時(shí)間為48h。發(fā)現(xiàn)DZNep不僅能夠抑制SAHH的表達(dá)，而且能夠抑制EZH2的表達(dá)，且后者作用更明顯。另外，DZNep能夠抑制EC9706和Eca