扶正化瘀方對肝星形細胞和肝竇內(nèi)皮細胞影響的實驗研究.pdf

1、背景:我國是肝病大國，慢性乙型肝炎患者數(shù)量占全世界的三分之一，慢性乙肝所引起的肝硬化甚至肝癌嚴重威脅患者的健康。纖維化是慢性肝病一個共同的病理過程，具有可逆性，我們可以通過研究肝纖維化的發(fā)生機制，尋求有效的藥物阻止肝纖維化的進展，從而減緩慢性肝病發(fā)展為肝硬化的進程。
　　 肝纖維化的研究較多，普遍肝星形細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是肝纖維化的中心事件，活化后的HSC產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)(extr

2、acellular matrix，ECM)，而基質(zhì)金屬蛋白酶分泌不足及其抑制劑分泌過多，過多的細胞外基質(zhì)沉積在肝臟而形成的一個病理過程。早期HSC的活化主要是由肝中kupffer細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、血小板等分泌各種細胞因子和生長因子引起，后期的持續(xù)活化則主要是由活化的HSC自分泌各種生長因子維持，活化后的HSC源源不斷地產(chǎn)生ECM，促進纖維化的進一步發(fā)展，其中重要的生長因子有轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth fa

3、ctor beta，TGF-β1)、血小板源性生長因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)等。
　　 在肝纖維化中，肝竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，SEC)的作用也受到越來越多的重視。SEC是肝竇壁的主要細胞成分，SEC是一種特殊的血管內(nèi)皮細胞，形

4、態(tài)與功能都與普通的血管內(nèi)皮細胞有較大的差別，首先SEC胞質(zhì)上有排列成篩狀的窗孔結(jié)構(gòu)，有利于肝細胞和血竇中各種成分進行交換。其次肝竇是一種不連續(xù)的毛細血管，內(nèi)皮下沒有基底膜的存在，僅有少量纖維結(jié)締組織，SEC也不表達普通血管內(nèi)皮細胞的標志物，它有自身獨特的標志物如CD4和CD14等。肝纖維化時，肝竇內(nèi)皮細胞發(fā)生毛細血管化，即失去窗孔結(jié)構(gòu)，并有內(nèi)皮下連續(xù)性基底膜的形成，此時表型也發(fā)生較大的改變，失去自身的標志物并開始表達普通血管內(nèi)皮的標志物

5、，如第Ⅷ因子相關(guān)抗原(Von Willebrand factor，vWF)、CD31和CD34等。
　　 目前，肝纖維化沒有特效的治療藥物，我國中藥及其復方因副作用小、多途徑、多靶點作用等特點，在肝纖維化治療中取得了較好的效果。扶正化瘀方（又稱319方）由丹參、蟲草菌絲、桃仁、絞股藍、五味子、松花粉組成，針對肝纖維化“瘀血阻絡(luò)、正氣虛弱”的基本中醫(yī)病因研制而成，有研究表明其具有保護肝細胞、抗脂質(zhì)過氧化、抑制促肝纖維化細胞因子生成

6、、抑制肝星形細胞增殖活化和膠原生成等作用。本實驗以肝星形細胞和肝竇內(nèi)皮細胞為出發(fā)點，研究扶正化瘀方抗肝纖維化的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供進一步的實驗依據(jù)。IFN-γ和β-雌激素是研究較多的抗纖維化藥物，研究表明均具有良好的抗纖維化作用，本實驗γ-干擾素和β-雌二醇作為陽性對照藥物。
　　 目的:探討扶正化瘀方對肝星形細胞和肝竇內(nèi)皮細胞功能的影響，從細胞水平證實扶正化瘀方的抗纖維化作用。
　　 方法:扶正化瘀方藥物粉末以0

7、.46g/10ml的容積配制成懸液，以0.46g/kg大鼠體重的劑量灌胃SD大鼠，采取二次重復給藥方式，即第一次灌胃2小時后再次灌胃，第二次灌胃后1小時心臟采血，并離心全血提取藥物血清，對照組是在相同條件下灌胃三蒸水并提取對照組血清，將兩組血清以10％的濃度分別配制成的扶正化瘀方藥物組培基（簡稱319組）和對照組培基。同時在對照組培基中分別加入γ-干擾素、β-雌二醇作為陽性對照藥物培基，四組培基分別作用于HSC和SEC48小時，用下列方

8、法檢測藥物對兩種細胞的影響:1.免疫細胞化學方法檢測HSC表達α-SMA、Desmin的情況;2.Western blot方法檢測HSC表達α-SMA、Desmin、TGF-β1、CTGF蛋白的情況;3.流式細胞術(shù)檢測HSC的增殖活性;4.免疫細胞化學和Western blot方法共同檢測SEC vWF、CD31的表達情況;5.掃描電鏡觀察SEC表面窗孔結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果:1.免疫細胞化學結(jié)果顯示319組HSC表達α-SM

9、A、Desmin均較對照組明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而319組、γ-干擾素組和β-雌二醇組組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);2.Western blot結(jié)果顯示319組HSCα-SMA、desmin、TGF-β1、CTGF蛋白的表達均較對照組明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而319組、γ-干擾素組和β-雌二醇組組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);3.流式細胞術(shù)顯示319組HSC增殖活力較對照組

10、降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而319組、γ-干擾素組和β-雌二醇組組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);4.免疫細胞化學和Westernblot結(jié)果顯示319組SEC vWF、CD31蛋白的表達均較對照組表達下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而319組、γ-干擾素組及β-雌二醇組組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05);5.掃描電鏡顯示對照組SEC大部分窗孔處于閉塞甚至消失狀態(tài)，而經(jīng)扶正化瘀方治療后SEC表面窗孔的