肝纖維化發(fā)生發(fā)展中肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、背景：肝纖維化是肝臟長(zhǎng)期遭受慢性損傷因素刺激后所發(fā)生的以細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）異常沉積為主要特征的病理變化。肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中ECM主要由活化的肌成纖維母細(xì)胞產(chǎn)生，但目前針對(duì)肌成纖維母細(xì)胞的來(lái)源問(wèn)題一直存在爭(zhēng)議。肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞（Liver Sinusoidal Endothelial Cells，LSECs）是肝臟組織特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞，其特異性主要表現(xiàn)為細(xì)胞表面具有豐富的窗孔結(jié)構(gòu)以及血管內(nèi)

2、皮基底膜的缺失。雖然肝血竇特異性周細(xì)胞——星型細(xì)胞（Hepatic Stellate Cells，HSCs）目前被認(rèn)為是肌成纖維母細(xì)胞的主要貢獻(xiàn)者，但既往文獻(xiàn)報(bào)道血管內(nèi)皮細(xì)胞也能夠通過(guò)內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（Endothelial Mesenchymal Transition，EnMT）過(guò)程轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細(xì)胞并參與到多種組織器官的纖維化進(jìn)展當(dāng)中，而LSECs作為肝臟組織中數(shù)量最大的一類(lèi)非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中是否具有轉(zhuǎn)分化為肌成

3、纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞的能力并參與促進(jìn)肝纖維化，是值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。
　　Notch信號(hào)通路對(duì)血管發(fā)育、血管新生、血管功能和組織器官穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。既往文獻(xiàn)表明，Notch信號(hào)是血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EnMT的始動(dòng)因素之一，并且Notch信號(hào)能夠通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EnMT而參與心臟的發(fā)育過(guò)程。包括我們課題組在內(nèi)的前期研究發(fā)現(xiàn)，血管特異性Notch信號(hào)在維持肝臟血管正常結(jié)構(gòu)、血管旁分泌功能和急性肝損傷后的血管重塑過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵角色

4、。而在慢性損傷因素導(dǎo)致的肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，LSECs特異性的Notch信號(hào)如何變化，以及Notch信號(hào)是否會(huì)通過(guò)調(diào)控LSECs的EnMT參與纖維化的發(fā)生發(fā)展，尚不清楚。
　　目的：明確在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，LSECs是否會(huì)通過(guò)EnMT轉(zhuǎn)分化為肌成纖維母細(xì)胞樣的細(xì)胞而參與肝纖維化；闡明LSECs特異性Notch信號(hào)是否在其EnMT過(guò)程中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。
　　方法：
　　1.分離提取小鼠原代LSECs并鑒定，在

5、其體外培養(yǎng)過(guò)程中，觀察毛細(xì)血管化的（Capilarized）LSECs是否存在EnMT樣轉(zhuǎn)變。
　　2.建立小鼠肝纖維化模型，通過(guò)免疫熒光染色觀察肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中LSECs與間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物的共定位情況。
　　3.分離提取小鼠肝纖維化不同階段的LSECs，在mRNA和蛋白水平檢測(cè)纖維化過(guò)程中LSECs特異性EnMT標(biāo)志物的變化情況。
　　4.通過(guò)遺傳示蹤小鼠模型驗(yàn)證肝纖維化病理過(guò)程中LSECs的EnMT現(xiàn)象，并通

6、過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)在單細(xì)胞層面證實(shí)LSECs能夠作為肌成纖維母細(xì)胞的前體細(xì)胞之一，在纖維化過(guò)程中獲得肌成纖維母細(xì)胞樣的特征。
　　5.分離靜息和纖維化條件下的HSCs和LSECs，通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法從基因表達(dá)譜層面驗(yàn)證LSECs在EnMT發(fā)生過(guò)程中獲得了肌成纖維母細(xì)胞樣特征，并對(duì)比其與傳統(tǒng)HSCs來(lái)源肌成纖維母細(xì)胞的異同。
　　6.通過(guò)免疫熒光染色等技術(shù)，在臨床肝硬化樣本中對(duì)LSECs的EnMT現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證。
　　7.

7、通過(guò) mRNA和蛋白水平的檢測(cè)，觀察纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中LSECs特異性Notch信號(hào)的變化情況。
　　8.構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞特異性Notch信號(hào)激活/阻斷小鼠模型，觀察內(nèi)皮特異性Notch信號(hào)激活/阻斷對(duì)小鼠肝纖維化、LSECs毛細(xì)血管化以及LSECs EnMT的影響。
　　9.在體外水平，通過(guò)使用Notch信號(hào)阻斷劑阻斷培養(yǎng)過(guò)程中LSECs的Notch信號(hào)，觀察其對(duì)體外LSECs自發(fā)性EnMT的挽救作用。
　　10.在體

8、內(nèi)外水平，通過(guò)使用可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（Soluble Guanylate Cyclase，sGC）激動(dòng)劑，抑制LSECs在體外培養(yǎng)和體內(nèi)肝纖維化過(guò)程中發(fā)生的毛細(xì)血管化，觀察LSECs的成熟分化狀態(tài)對(duì)EnMT的影響，初步探索LSECs的EnMT與毛細(xì)血管化現(xiàn)象的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.我們通過(guò)免疫磁珠分選（Magnetic Activated Cell Sorting，MACS）的方法成功從小鼠肝臟分離提取出原代LSEC

9、s，經(jīng)FACS驗(yàn)證所提取的LSECs99.7％為VEGFR3+CD34-，體外培養(yǎng)貼壁的LSECs光鏡下形態(tài)均一，細(xì)胞具有吞噬甲醛化白蛋白（Formaldehyde-treated Serum Albumin，F(xiàn)SA）和乙?；兔芏戎鞍祝ˋcetyl Low Density Lipoprotein，acLDL）的能力，掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）觀察到細(xì)胞表面擁有特征性的窗孔結(jié)構(gòu)。在LS

10、ECs體外培養(yǎng)過(guò)程中我們觀察到毛細(xì)血管化的LSECs逐漸呈現(xiàn)出長(zhǎng)梭形間質(zhì)樣細(xì)胞的形態(tài)，通過(guò)mRNA水平和蛋白水平的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管化的LSECs表達(dá)出明顯的間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物——如α平滑肌動(dòng)蛋白（alpha Smooth Muscle Actin，a-SMA）、平滑肌22α（Smooth Muscle22 alpha，Sm22）和I型膠原（Type I Collagen，Col-1）等。
　　2.我們?cè)谝吧鶦57小鼠上建立了CCl4

11、肝纖維化模型，SEM下可見(jiàn)LSECs在損傷早期、膠原纖維出現(xiàn)之前即發(fā)生毛細(xì)血管化，與文獻(xiàn)報(bào)道相同。通過(guò)免疫熒光染色觀察到，在纖維瘢痕沉積的匯管區(qū)以外區(qū)域，存在明顯LSECs與肌成纖維母細(xì)胞標(biāo)志物a-SMA、Sm22和Col-1的共定位，并且這種共定位現(xiàn)象在靜息狀態(tài)下就存在，而且在肝損傷早期便會(huì)大量出現(xiàn)。此外，我們?cè)谀懝芙Y(jié)扎（Bile Duct Ligation，BDL）肝纖維化模型中也驗(yàn)證了這種共定位現(xiàn)象。
　　3.進(jìn)一步我們分離

12、了纖維化不同時(shí)間點(diǎn)的LSECs，通過(guò)mRNA水平和蛋白水平的檢測(cè)，證實(shí)了隨著纖維化的進(jìn)展，LSECs中的肌成纖維母細(xì)胞樣標(biāo)志物出現(xiàn)明顯升高，并且這些間質(zhì)樣標(biāo)志物在靜息態(tài)LSECs中便能夠被檢測(cè)到，而在肝損傷發(fā)生后表達(dá)立刻升高。
　　4.為進(jìn)一步明確纖維化過(guò)程中 LSECs的 EnMT現(xiàn)象，我們構(gòu)建了Cdh5CreROSA-YFPstop/flox遺傳示蹤小鼠，在此小鼠的基礎(chǔ)上建立CCl4和BDL肝纖維化模型，通過(guò)激光共聚焦同樣追蹤

13、到Y(jié)FP+LSECs與肌成纖維母細(xì)胞樣標(biāo)志物的共定位。隨后我們分離了對(duì)照組和纖維化組Cdh5CreROSA-YFPstop/flox小鼠的LSECs，通過(guò)FACS檢測(cè)，我們?cè)趩渭?xì)胞水平證實(shí)了靜息態(tài)YFP+LSECs作為一種具有肌成纖維母細(xì)胞樣特征的前體細(xì)胞，在肝纖維化時(shí)能夠發(fā)生EnMT。
　　5.將靜息和纖維化條件下的HSCs和LSECs進(jìn)行分離后測(cè)序，在表達(dá)譜層面，通過(guò)主成分分析（Principal Component Anal

14、ysis，PCA）我們發(fā)現(xiàn)LSECs通過(guò)EnMT途徑轉(zhuǎn)變而來(lái)的肌成纖維母細(xì)胞與傳統(tǒng)意義上HSCs活化而來(lái)的肌成纖維母細(xì)胞屬于不同的細(xì)胞亞群，但兩者在肌成纖維母細(xì)胞活化相關(guān)基因的表達(dá)模式上存在相似性。
　　6.通過(guò)對(duì)臨床肝硬化患者硬化肝臟標(biāo)本的免疫熒光染色，我們同樣證實(shí)了人LSECs在肝硬化背景下也能夠發(fā)生EnMT，并且天狼猩紅染色結(jié)果提示——發(fā)生EnMT的LSECs可能與血竇性纖維化關(guān)系更密切。
　　7.在mRNA水平和蛋白

15、水平，我們通過(guò)對(duì)纖維化不同時(shí)間點(diǎn)LSECs Notch信號(hào)下游靶分子Hes1和Hey1的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LSECs中的Notch信號(hào)在損傷早期被抑制，但隨著損傷因素的持續(xù)刺激，LSECs中的Notch信號(hào)被持續(xù)活化，提示Notch信號(hào)的激活有可能參與LSECs的EnMT過(guò)程。
　　8.為進(jìn)一步研究Notch信號(hào)在LSECs EnMT中的作用，我們構(gòu)建了Cdh5CreERT ROSA26-N1ICDstop/flox內(nèi)皮特異性Notch信

16、號(hào)激活轉(zhuǎn)基因小鼠和Cdh5CreERTRBP-jflox/flox內(nèi)皮特異性Notch信號(hào)阻斷轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)建立CCl4肝纖維化模型，我們發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中激活Notch信號(hào)加重了小鼠的肝纖維化、肝血竇毛細(xì)血管化和LSECs的EnMT；相反，內(nèi)皮細(xì)胞中阻斷Notch信號(hào)能夠減弱肝血竇毛細(xì)血管化和LSECs的EnMT，但其并未能顯著減輕肝纖維化程度。
　　9.在體外培養(yǎng)的LSECs中，我們通過(guò)GSI阻斷Notch信號(hào)后發(fā)現(xiàn)，Notc

17、h阻斷能夠挽救LSECs體外培養(yǎng)過(guò)程中的自發(fā)性EnMT現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的間質(zhì)樣形態(tài)變化被抑制以及肌成纖維母細(xì)胞樣標(biāo)志物表達(dá)的減少。
　　10.為闡明LSECs的EnMT與毛細(xì)血管化的關(guān)系，我們對(duì)體外培養(yǎng)的LSECs給予sGC激動(dòng)劑YC-1處理后發(fā)現(xiàn)，YC-1在抑制LSECs發(fā)生毛細(xì)血管化的同時(shí)，也抑制了LSECs自發(fā)性EnMT的發(fā)生；同時(shí)YC-1在體內(nèi)能夠減輕小鼠的肝纖維化程度并改善肝損傷。以上結(jié)果提示EnMT與毛細(xì)血管化有可能是

18、LSECs的同一病理過(guò)程在不同層面的定義，阻止LSECs EnMT的發(fā)生是治療肝纖維化的有效手段之一。
　　結(jié)論：
　　1.LSECs作為一種潛在的肌成纖維母細(xì)胞的前體細(xì)胞，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中能夠通過(guò)EnMT轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維母細(xì)胞。
　　2.Notch信號(hào)通路參與調(diào)控了LSECs的EnMT病理過(guò)程。
　　3.LSECs的EnMT與毛細(xì)血管化可能是同一種病理變化，阻斷LSECs發(fā)生EnMT有可能成為抑制肝纖維化