復方鱉甲軟肝方藥物血清干預庫普弗細胞對肝星形細胞增殖和活化影響的研究.pdf

1、目的肝星形細胞(HSC)的激活受到包括肝細胞、庫普弗細胞(KC)、肝竇內皮細胞在內的多種細胞產(chǎn)生的各類細胞因子的調節(jié)。庫普弗細胞條件培養(yǎng)基(KCCM)中KC分泌的各種細胞因子能促進HSC激活。本研究旨在探討KCCM與HSC應答反應之間以及HSC增殖和活化的影響，以及復方鱉甲軟肝方藥物血清對其的干預作用，為簡述中醫(yī)藥防治肝纖維化作用機制進一步提供實驗依據(jù)。 藥物復方鱉甲軟肝方(片)原料粉(不含輔料)由內蒙古中蒙藥科技股份有限公司提

2、供。本實驗采取的復方鱉甲軟肝方由鱉甲、黨參等十一味中藥組成。其主要功能為扶正祛邪，活血化瘀。扶正：黨參健脾益氣，紫河車益腎填精。驅邪：板藍根清熱解毒?；钛觯瑚M甲，入肝、腎經(jīng)，既可軟煎散結，又可滋陰潛陽。當歸：養(yǎng)血活血。莪術：行氣祛瘀。其臨床有效率達81.67％，治愈率達55.23％。 方法1.造模：健康SD大鼠30只，分成2組，即模型組20只、正常組10只。參照并改進Hernandez-Munoz法建立肝纖維化動物模型，腹腔

3、注射0.2mlCCL4(花生油1：6稀釋)，每周三次，共六周。 2.制備藥物血清：將復方鱉甲軟肝方按人體劑量的3.5倍、7倍、14倍制備成低、中、高三個劑量組，按1ml/100g(每毫升分別含藥物0.035g、0.07g、0.14g)0大鼠體重分別給大鼠灌胃7次，每次間隔12小時，第7次給藥前12小時禁食。對照組給予蒸餾水灌胃，方法同上。 3.原代細胞分離與培養(yǎng)：采用Collagenase原位肝臟灌流法，nycodenz

4、梯度密度離心分離HSC、KC。 4.KCCC的制備：KC培養(yǎng)48小時，收集培養(yǎng)液，0，22um微孔濾器過濾，-20℃保存?zhèn)溆?。用時與含10％新生牛血清DMEM培養(yǎng)基按1：16、1：8、1：4稀釋。 5.實驗以正常大鼠為陰性對照，分別采用①MTT方法觀察復方鱉甲軟肝方藥物血清干預KCCM對HSC增殖的影響；②免疫組織化學的方法觀察復方鱉甲軟肝方藥物血清干預KCCM對HSC表達α-SMA和TGF-β1的影響；③western

5、-blot方法觀察觀察復方鱉甲軟肝方藥物血清干預KCCM對HSC表達TGF-β1的影響。 6.采用SPSS11.0軟件對相關實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，求平均數(shù)，作單因素方差分析。 開展的相關實驗：1.分離肝纖維化大鼠肝臟KC和正常大鼠KC、HSC，培養(yǎng)并鑒定2.復方鱉甲軟肝方藥物血清干預KCCM對HSC增殖的影響3.復方鱉甲軟肝方藥物血清干預KCCM對HSC表達α-SMA的影響4.復方鱉甲軟肝方藥物血清干預KCCM對HSC

6、分泌TGF-β1的影響 5.復方鱉甲軟肝方藥物血清干預KCCM對HSC中TGF-β1蛋白表達的影響通過統(tǒng)計學分析及各指標之間關系的深入探討，研究結果如下：1.KCCM內的細胞因子能促進HSC增殖、活化、表達α-SMA、分泌TGF-β1、增加TGF-β1蛋白表達水平；尤以MKCCM促進作用更強烈。提示MKCCM內細胞因子活性更強。 2.復方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制MKCCM所致HSC增殖。提示復方鱉甲軟肝方具有抑制HS

7、C增殖、進而抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展的作用。 3.復方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制MKCCM所致HSC表達α-SMA。提示復方鱉甲軟肝方具有抑制HSC活化、進而抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展的作用。 4.復方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制MKCCM所致HSC分泌TGF-β1。提示提示復方鱉甲軟肝方具有抑制HSC向MFB轉化進程、抑制肝細胞的再生，又促進肝細胞凋亡的作用。 5.復方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制MKCCM所致

8、HSC的TGF-β1蛋白表達。提示提示復方鱉甲軟肝方可以從蛋白水平發(fā)揮治療作用。 6.上述實驗說明肝纖維化是多細胞和細胞因子共同參與的結果，KC和HSC之間存在復雜的關系。復方鱉甲軟肝方藥物血清的上述抗肝纖維化作用，體現(xiàn)了中藥復方多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)的作用機制。 結論通過以上實驗結果得出以下結論：1.KCCM可促進HSC增殖和活化。2.復方鱉甲軟肝方藥物血清可顯著抑制KCCM所致HSC活化。3.復方鱉甲軟肝方藥物血清可