低氧預(yù)適應(yīng)對大鼠移植肝臟肝竇內(nèi)皮細(xì)胞影響的實驗研究.pdf

1、1.目的本實驗在建立大鼠原位活體肝移植(orthotopiclivertransplantation，OLT)模型的基礎(chǔ)上，通過對供肝大鼠術(shù)前低氧預(yù)適應(yīng)處理(hypoxicpreconditioning，HP)，研究移植肝臟術(shù)后2h、24h和48h肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的功能、結(jié)構(gòu)變化，同時探討這些病理變化與HP相關(guān)的HIF-1a表達(dá)的相互關(guān)系，研究HP對肝移植大鼠肝臟的影響。 2.方法2.1清潔級SD大鼠，隨機分為3組，模型對照組(A組

2、)：不進行低氧處理的原位肝移植組共30例；低氧移植組(B組)：供肝大鼠先進行90min的低氧適應(yīng)，然后于8小時后切除肝臟作為供肝，行原位肝臟移植。C組：正常大鼠。兩組肝移植大鼠均采用Kamada的二袖套法，并加技術(shù)改進施行大鼠原位肝移植。 2.2各組大鼠均在肝移植術(shù)后2h、24h和48h處死六只，切取肝中葉作為標(biāo)本，做肝組織切片在光鏡、電鏡下觀察SEC的結(jié)構(gòu)變化及其超微結(jié)構(gòu)的變化。SP免疫組織化學(xué)法檢測HIF-1a的表達(dá)。放射免

3、疫法檢測血清ET-1及HA的含量。全自動生化分析儀測定肝功能各項指標(biāo)。 3.結(jié)果3.1OLT大鼠手術(shù)成功的標(biāo)準(zhǔn)是手術(shù)結(jié)束后，大鼠即刻蘇醒、翻身，并能維持有效的呼吸、心跳。兩組有效肝移植大鼠例數(shù)各為30對。實驗組冷缺血時間控制在(51.1±3.2)min，無肝期為(20±2.2)min。各組經(jīng)腹主動脈灌注引起的肝臟熱缺血時間可以忽略不計(一般＜5秒)。一周存活率B組明顯高于A組(P＜0.05)。 3.2各組肝移植大鼠術(shù)后2

4、h，檢測顯示：A、B兩組肝功能各項均未見明顯差異，24hB組ALB顯著高于A組，TBIL、ALT、AST、ALP均顯著低于A組，48hTBIL、AST、ALP均顯著低于A組(P＜0.05)。 3.3兩移植組術(shù)后光鏡觀察均有不同程度的細(xì)胞水腫甚至死亡，肝板增厚，肝竇狹窄，肝細(xì)胞脂肪變性，但B組的改變要輕于A組，A組于24h后肝竇內(nèi)出現(xiàn)淤積的紅細(xì)胞和血栓。電鏡觀察術(shù)后2hA組SEC出現(xiàn)斷裂，肝竇內(nèi)有大量空泡形成，竇腔見血細(xì)胞淤積，B

5、組的改變與A組相似，核周長增加。24h后SEC腫脹，核增大，胞內(nèi)見擴張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體腫脹及空泡化，SEC向竇腔突出甚至脫落，但B組腫脹要輕于A組，線粒體未見明顯空泡化，核面積、周長、直徑與A組均有明顯差異(P＜0.05)，線粒體的OD下降但未有明顯差異(P＞0.05)。48h后A組SEC形態(tài)明顯改變，線粒體空泡化明顯，核異形性增加，胞質(zhì)疏松水腫，易見致密包含體，部分SEC胞膜內(nèi)陷出現(xiàn)調(diào)亡，脫落入竇腔，同壞死的SEC等組織填塞竇腔，B組

6、SEC明顯變性但無明顯死亡，外觀增大，線粒體數(shù)目明顯增多但腫脹不明顯，有SEC胞膜內(nèi)陷，胞質(zhì)疏松水腫，散見致密包含體，未見明顯壞死及竇腔填塞。SEC核面積、核周長、核直徑、細(xì)胞平均灰度及線立體OD值與A組均有明顯差異。 3.4正常肝臟HIF-1a蛋白均勻分布門靜脈和肝靜脈周圍細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，以細(xì)胞核中分布較多，極少量分布在中央靜脈周圍的內(nèi)皮細(xì)胞中，無區(qū)帶差異。B組肝移植術(shù)后2h，HIF-1a在肝小葉呈I帶向Ⅲ帶逐漸加重的細(xì)胞漿

7、表達(dá)，SEC的表達(dá)強于肝細(xì)胞，中央靜脈周圍的SEC最為明顯，呈深褐色，陽性細(xì)胞數(shù)及染色面積較對照組有顯著增加，表達(dá)量明顯高于對照組(P＜0.01)及A組(P＜0.05)。術(shù)后24h的表達(dá)仍維持在較高水平，48hHIF-h的表達(dá)呈減退趨勢，在細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)域內(nèi)，HIF-1a仍呈非差異性表達(dá)。A組術(shù)后24hHIF-1a的表達(dá)減少。48h后的表達(dá)已接近與正常水平，陽性細(xì)胞數(shù)及染色面積較B組均有明顯差異(P＜0.05)。 3.5術(shù)后

8、2hA、B組HA的水平均明顯增高(P＜0.05)，為血清正常水平的數(shù)倍，但B組HA的增高明顯低于A組。術(shù)后24h和48hA、B組的HA水平均明顯下降，到48hB組雖仍高于正常水平，但與正常值無明顯差異，而A組的血清水平仍高于正常(P＜0.05)。而實驗中除A組術(shù)后24h的盯-1值較正常值明顯增高外(P＜0.05)，其余各組均未見明顯差異。 4.結(jié)論肝移植后大鼠一周存活率與供肝的缺血缺氧-再灌注損傷時程度呈負(fù)相關(guān)，HP對移植肝臟具