微囊藻毒素LR對肝細胞系HL7702內(nèi)的蛋白磷酸酶PP2A下游靶點的影響.pdf

1、水體富營養(yǎng)化導致的水華暴發(fā)不僅嚴重毒害水生生物，使整個水體生態(tài)失衡，并且能夠通過被污染的水產(chǎn)品，農(nóng)產(chǎn)品或者有毒的飲用水間接或直接危害人類的健康。微囊藻毒素(microcystin，MC)是水華暴發(fā)時藍藻的一些屬產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，化學性質(zhì)穩(wěn)定，很難將其從水中除去，該毒素具有多種毒性效應，因此深入研究其致毒機理具有非常重要的意義。
　　 微囊藻毒素是一種單環(huán)七肽類化合物，其中5個氨基酸為固定成分，X，Y為兩種可變氨基酸，由此可產(chǎn)生

2、80多種異構體。微囊藻毒素LR(MC-LR)是微囊藻毒素中存在最為普遍且毒性作用最明顯的一種，L，R分別代表亮氨酸，精氨酸。微囊藻毒素的致毒效應表現(xiàn)出明顯的器官選擇性，肝臟是微囊藻毒素最主要的靶器官。急性暴露于微囊藻毒素引起肝臟腫大，肝內(nèi)出血甚至肝功能衰竭；流行病學調(diào)查表明，低濃度的微囊藻毒素長時間暴露與人群中肝癌的發(fā)生密切相關。微囊藻毒素的肝毒性是由于肝臟中表達特殊的有機陰離子轉運多肽系統(tǒng)(organicaniontransporti

3、ngpolypeptides，OATPs)，可將微囊藻毒素大量地轉運入細胞。此外，除了肝臟毒性之外，微囊藻毒素還具有腎毒性、腸毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性，引起腎上腺，腸道相關疾病、生殖系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷等。
　　 對徼囊藻毒素致毒機理的研究表明，微囊藻毒素能夠引起細胞骨架的改變、誘導細胞凋亡、誘導活性氧(ROS)生成引起脂質(zhì)過氧化、激活細胞內(nèi)信號傳導通路等多種細胞效應。MC-LR是蛋白磷酸酶2A(Proteinphosphata

4、se2A，PP2A)的強效抑制劑，對PP2A的特異性抑制可能是造成其毒作用機制錯綜復雜的原因之一。然而到目前為止，微囊藻毒素進入肝細胞后，引發(fā)的可能與PP2A相關的細胞效應以及各個細胞效應間的聯(lián)系并不十分清楚。盡管目前蛋白質(zhì)組學大量篩選出了可能是微囊藻毒素抑制PP2A后的下游靶點蛋白，但是這些結果并不能動態(tài)和全面的反應PP2A下游的細胞效應以及各個效應之間的聯(lián)系。以肝細胞為模型來探究微囊藻毒素致毒機理的研究也非常少。
　　 因此

5、，為進一步探索以PP2A為主線的微囊藻毒素毒可能引起的細胞效應以及各個細胞效應間的聯(lián)系，在本研究中，我們應用人肝細胞系HL7702為模型，以蛋白磷酸酶PP2A為線索，探索MC-LR抑制PP2A活性后可能引起的下游靶蛋白變化和肝細胞內(nèi)的MC-LR應激效應，并試圖構建以PP2A為中心的肝細胞暴露于MC-LR后的細胞內(nèi)應答通路，為微囊藻毒素的致毒機理提供更多的依據(jù)。
　　 本研究的檢測內(nèi)容主要包括兩個部分。第一部分檢測MC-LR引起的

6、肝細胞內(nèi)細胞效應，主要內(nèi)容包括：檢測MC-LR對蛋白磷酸酶PP2A活性的影響；MC-LR對MAPK家族蛋白的影響；MC-LR對細胞骨架以及一些骨架相關蛋白的影響；MC-LR對細胞周期的影響；MC-LR對細胞存活力的影響。第二部分檢測MC-LR引起的細胞效應之間的聯(lián)系，主要包括：應用PP2A激活劑D-erythro-Sphingosine(DES)后對PP2A下游影響的驗證；應用MAPK激酶抑制劑檢測MAPK對下游靶點的調(diào)控。
　　

7、 第一部分主要結果：
　　 1.MC-LR暴露于HL7702細胞后，與PP2A催化亞基結合，抑制PP2A活性。
　　 2.MC-LR暴露于HL7702細胞后，引起MAPK家族p38MAPK，ERK和JNK蛋白磷酸化水平升高；并且ERK，JNK的磷酸化修飾早于p38MAPK。
　　 3.MC-LR染毒HL7702細胞引起乙?；⒐艿鞍妆磉_降低；引起酪氨酸化微管蛋白在細胞內(nèi)的排列變化；引起微絲和徼管在細胞內(nèi)的排列改

8、變。
　　 4.MC-LR染毒HL7702細胞引起Tau，HSP27，VASP蛋白磷酸化表達增加；影響Tau，HSP27在細胞骨架部分的分布。
　　 5.MC-LR染毒HL7702細胞引起細胞周期相關蛋白p53，cdc2，cdc25c的磷酸化修飾發(fā)生改變，但是并沒有引起細胞周期改變。
　　 6.在本研究條件下，MC-LR染毒HL7702細胞并沒有影響細胞存活力。
　　 第二部分主要結果：
　　 1

9、.應用PP2A激動劑DES作用于細胞后，DES能夠減弱MC-LR引起的Tau蛋白，HSP27的磷酸化升高效應。DES能夠降低細胞周期相關的p53，cdc25c，cdc2的磷酸化水平。
　　 2.應用免疫熒光技術分別檢測B55α、B56α與細胞周期相關蛋白的共定位，結果在MC-LR處理細胞組B56α和磷酸化cdc25c出現(xiàn)共定位，并且共定位更多的集中在細胞膜下皮質(zhì)層的胞漿中。
　　 3.分別應用MAPK抑制劑后，驗證HSP

10、27，Tau的磷酸化水平改變，結果顯示：p38MAPK和JNK抑制劑能夠減低HSP27的磷酸化修飾水平；p38MAPK抑制劑能夠減低Tau的磷酸化水平。
　　 主要結論：
　　 1.MC-LR染毒HL7702細胞后，能夠與PP2A催化亞基結合，抑制PP2A的活性。
　　 2.MC-LR染毒能夠激活MAPK三條經(jīng)典的信號通路p38MAPK通路，ERK通路，JNK通路；但是p38MAPK通路對MC-LR的反應敏感性低

11、于ERK和JNK通路。
　　 3.MC-LR通過影響乙?；⒐艿鞍住⒗野彼峄⒐?、F-actin和微管重新排列而引起細胞骨架的穩(wěn)定性下降；PP2A被抑制激活p38MAPK引起下游Tau的磷酸化增加，從而影響Tau穩(wěn)定微管的功能；p38MAPK和JNK激酶調(diào)節(jié)下游HSP27蛋白，使HSP27蛋白磷酸化表達增加來抵抗骨架的損傷。
　　 4.MC-LR能夠通過PP2A影響細胞周期相關的蛋白p53，cdc25，cdc2的磷酸化水