鎘對(duì)蛋白磷酸酶2C的內(nèi)皮細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及意義：
　　動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的主要發(fā)病原因。動(dòng)脈粥樣硬化的原因非常復(fù)雜，內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞凋亡、血脂異常、炎性細(xì)胞浸潤、脂質(zhì)沉積、氧化應(yīng)激、膠原代謝異常、血管生成等因素均在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起作用。其中，內(nèi)皮功能障礙在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段發(fā)揮了主要的作用。所以，維持內(nèi)皮的正常功能對(duì)于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化有重大的意義。
　　重金屬離子鎘(Cadmium，Cd)是一種不可降解的污染物，嚴(yán)重危害人體健康。

2、環(huán)境中的鎘不能被生物降解，導(dǎo)致含量逐年上升，被某些植物攝取而進(jìn)入食物鏈。人類從食物、水、空氣和土壤中接觸鎘，鎘極易在體內(nèi)蓄積，半衰期長達(dá)10-30年，對(duì)心血管系統(tǒng)、腎臟、肝臟、肺及睪丸等器官系統(tǒng)產(chǎn)生一系列損害。環(huán)境中的鎘進(jìn)入人體后會(huì)沉積在心臟和血管，心血管系統(tǒng)是鎘毒性作用的靶器官之一。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明鎘對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的起始有一定作用并能促進(jìn)其發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，鎘能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，加速動(dòng)脈粥樣斑塊形成;能增加活性氧的形成，通過結(jié)合金屬硫蛋白干

3、擾氧化應(yīng)激反應(yīng)。另外，鎘也可以通過升高血壓、腎臟損傷、鎘相關(guān)的雌激素活性改變或表觀遺傳變化來影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。鎘毒性的機(jī)制很復(fù)雜，主要包括抑制鋅指蛋白的功能、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)、改變活性氧、抑制DNA修復(fù)等。但是這些機(jī)制與鎘誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣化形成的相關(guān)性還不甚明確。
　　在蛋白質(zhì)的翻譯后修飾中，可逆性蛋白磷酸化/去磷酸化的調(diào)節(jié)需要蛋白激酶和蛋白磷酸酶的共同參與，這一過程參與了幾乎所有細(xì)胞功能的調(diào)控，包括細(xì)胞生長、免疫應(yīng)答及細(xì)

4、胞代謝等。人類蛋白磷酸酶家族包括大約100種酪氨酸磷酸酶(protein tyrosinephos phatase，PTP)和40種絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，后者需要金屬離子激活一個(gè)水分子來實(shí)施其去磷酸化的作用。蛋白磷酸酶2C(proteinphosphatase2C，PP2C)，即Mn2+/Mg2+依賴性蛋白磷酸酶(proteinphosphatasemagnesium/manganium-dependent，PPM)，二價(jià)金屬離子與其結(jié)

5、合后可以發(fā)揮激活或抑制其磷酸酶活性的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物中PP2C家族的16種基因至少編碼了22種亞型。這些蛋白在調(diào)節(jié)應(yīng)激信號(hào)通路、信使RNA前體的剪接、蛋白泛素化和降解、細(xì)胞代謝以及細(xì)胞死亡/存活信號(hào)通路中起著重要的作用。PPM1A，亦稱PP2Cα，是PP2C家族中最具代表性的成員，在幾乎所有的組織都有表達(dá)，參與了很多重要信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。已報(bào)道PPM1A可以去磷酸化腺苷活化蛋白激酶，進(jìn)而抑制其活化，在保證心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中起了

6、重要作用。PPM1A是絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路中重要的負(fù)調(diào)控因子，可抑制c-jun氨基末端激酶(c-junN-terminalkinase，JNK)和p38MAPK的活化。作為PP2C家族的典型代表，PPM1A可被Mn2+、Mg2+、Fe2+等激活，可被Ca2+抑制，但能否被Cd2+抑制仍不清楚。以往研究表明，長期接觸Cd2+會(huì)降低蛋白磷酸酶5和蛋白磷酸酶

7、2A的A亞基的蛋白水平，但是Cd2+是否是通過直接結(jié)合蛋白激酶或蛋白磷酸酶來調(diào)節(jié)蛋白的磷酸化水平還未曾進(jìn)行過深入的研究。進(jìn)一步研究Cd2+與磷酸酶的相互作用，對(duì)于治療鎘對(duì)機(jī)體的毒性包括鎘對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的促進(jìn)，具有重要意義。
　　整個(gè)論文分為三大部分，第一部分，我們研究了不同金屬離子對(duì)PP2C家族的作用，發(fā)現(xiàn)Cd2+可以特異而有效地抑制PPM1A和PPM1G，抑制常數(shù)Ki小于1μM;第二部分，我們重點(diǎn)探討了Cd2+對(duì)PPM1A和PP

8、M1G的抑制作用及機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Cd2+是通過作用于PP2C的M1金屬離子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮抑制作用的;第三部分，我們發(fā)現(xiàn)低濃度的Cd2+可以在一定程度上抑制PPM1A引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，而高濃度的Cd2+可以通過氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，對(duì)進(jìn)一步探討Cd2+與動(dòng)脈粥樣化發(fā)生發(fā)展的關(guān)系具有重要意義。
　　第一部分：金屬離子對(duì)蛋白磷酸酶2C的作用
　　研究目的：
　　探討二價(jià)金屬離子對(duì)PP2C磷酸酶家族的作用。
　　研

9、究方法：
　　1.質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白純化
　　將PPM1A、PPM1G野生型序列亞克隆到pet30a原核表達(dá)載體上，通過Ni-NTA親和層析進(jìn)行蛋白純化。
　　2.酶動(dòng)力學(xué)研究
　　(1)對(duì)小分子底物磷酸對(duì)硝基苯酯(p-nitrophenylphosphate，pNPP)的磷酸酶活力測定:分別在Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Sr2+、Cr2+、Ba2+和Li

10、+存在的條件下，測定PPM1A或PPM1G對(duì)pNPP的去磷酸化活性。
　　(2)對(duì)ppERK短肽、pp38短肽磷酸酶活力:短肽作為底物，Mn2+作為激活劑，Cd2+作為抑制劑。
　　(3)對(duì)體外純化pERK2蛋白的磷酸酶活力:磷酸化pERK2蛋白作為底物，Mn2+作為激活劑，Cd2+作為抑制劑。
　　結(jié)果：
　　Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+和Ni2+可以激活PPM1A和PPM1G，其激活能力:Fe2+＞

11、Mn2+＞Mg2+＞Co2+＞Ni2+;Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Sr2+、Cr2+、Ba2+和Li+可以抑制PPM1A和PPM1G的活性，其抑制能力:Cd2+＞Zn2+＞Hg2+＞Ca2+＞Sr2+＞(Cr2+，Ba2+)＞Li+。Cd2+是PP2C家族特異而有效地抑制劑。
　　第二部分：鎘通過作用于PP2C的M1金屬離子結(jié)合位點(diǎn)抑制PP2C的活性
　　研究目的：
　　研究Cd2+對(duì)PP2C抑制作用的分

12、子機(jī)制。
　　研究方法：
　　1.質(zhì)粒構(gòu)建與蛋白純化
　　將PPM1A、PPM1G野生型序列亞克隆到pet30a原核表達(dá)載體和pcDNA3.1真核表達(dá)載體上，并以該表達(dá)質(zhì)粒為模板構(gòu)建一系列的突變。pet30a-PPM1A、pet30a-PPM1G及其突變的表達(dá)和純化通過Ni-NTA親和層析進(jìn)行蛋白純化。
　　2.野生型PPM1A、PPM1G及不同突變體的酶動(dòng)力學(xué)研究
　　1)對(duì)小分子底物pNPP的磷酸酶活力

13、:pNPP作為底物，Mn2+作為激活劑，Cd2+作為抑制劑。
　　2)對(duì)體外純化pERK2蛋白的磷酸酶活力:磷酸化pERK2蛋白作為底物，Mn2+作為激活劑，Cd2+作為抑制劑。
　　3.細(xì)胞功能檢測
　　1)細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路及Akt信號(hào)通路
　　人胚胎腎293細(xì)胞(HumanEmbryonicKidney293cell，HEK293)轉(zhuǎn)染野生型PPM1A、PPM1G及其突變后，加入Cd2+孵育，檢測Cd2

14、+抑制PPM1A、PPM1G或其突變后，pERK1/2、pP38、pJNK及pAKT的磷酸化水平。
　　2)細(xì)胞周期
　　HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型PPM1A后，加入Cd2+孵育，檢測Cd2+抑制PPM1A后，細(xì)胞周期的變化。
　　結(jié)果：
　　1.Cd2+通過M1金屬離子結(jié)合位點(diǎn)抑制PPM1A和PPM1G的磷酸酶活性。
　　PPM1A的第60位的天冬氨酸(D60)、第239位的天冬氨酸(D239)和第282

15、位的天冬氨酸(D282)共同組成了PPM1A的M1金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。同理，PPM1G的D60、第441位的天冬氨酸(D441)和第496位的天冬氨酸(D496)共同組成了PPM1G的M1金屬離子結(jié)合位點(diǎn)。D60A和D60N這2個(gè)突變體降低了Mn2+與酶的結(jié)合能力，同時(shí)也降低了Cd2+的抑制作用。除此之外，PPM1A的D239和D282突變及PPM1G的D441和D496突變也大大降低了Cd2+的抑制效能。相反，組成M2金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的

16、氨基酸突變后，對(duì)Cd2+的抑制作用沒有太大影響。
　　2.Cd2+無法抑制M1金屬離子結(jié)合位點(diǎn)的相關(guān)突變體對(duì)蛋白底物去磷酸化作用。
　　1.5μM的Cd2+即可充分阻斷野生型PPM1A和PPM1G催化的pERK蛋白的去磷酸化作用。但是1.5μMCd2+卻無法阻斷D282A和D239K對(duì)pERK蛋白的去磷酸化作用。
　　3.在細(xì)胞內(nèi)低濃度的Cd2+可以抑制PPM1A和PPM1G調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。
　　HEK293細(xì)胞

17、過表達(dá)PPM1A或D239K突變后，pERK、p38和pJNK的磷酸化水平明顯減少，但是加入1.5μMCd2+孵育6小時(shí)后，PPM1A無法發(fā)揮對(duì)pERK、p38及pJNK的去磷酸化作用，導(dǎo)致磷酸化水平增加;而相同濃度的Cd2+卻無法抑制D239K突變對(duì)pERK、p38及pJNK的去磷酸化作用。
　　4.Cd2+可以反轉(zhuǎn)PPM1A對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。
　　HEK293細(xì)胞過表達(dá)PPM1A后，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停滯在G2/M期，但是

18、加入1.5μMCd2+孵育24小時(shí)后阻斷了這一停滯。
　　第三部分：鎘對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響
　　研究目的：
　　探討Cd2+對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　　研究方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及Cd2+處理
　　人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)培養(yǎng)于含有0.1mg/ml肝磷酯、0.03-0.05mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(endot

19、helialcellgrowthsupplement,ECGS)和10％胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)的F-12K培養(yǎng)基中。用不同濃度的Cd2+處理不同的時(shí)間后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2.MTT法檢測Cd2+對(duì)細(xì)胞增殖的影響，Tunel法檢測Cd2+對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　(1)分別檢測不同濃度的Cd2+孵育細(xì)胞24個(gè)小時(shí)后，及10μM的Cd2+孵育細(xì)胞不同時(shí)間后，細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的變化。
　　(2)

20、過表達(dá)PPM1A野生型質(zhì)粒后，用1μM的Cd2+孵育細(xì)胞24個(gè)小時(shí)，檢測細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的變化。
　　(3)將細(xì)胞內(nèi)源性PPM1A干擾后，用1μM的Cd2+孵育細(xì)胞24個(gè)小時(shí)，檢測細(xì)胞增殖的變化。
　　3.檢測Cd2+對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD活性影響
　　用不同濃度的Cd2+處理細(xì)胞24個(gè)小時(shí)，檢測細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD活性的變化。
　　結(jié)果：
　　Cd2+對(duì)HUVECs增殖及凋亡的影響具有濃度依賴性和時(shí)間依

21、賴性。低濃度的Cd2+會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度的Cd2+會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另外，低濃度的Cd2+可以抑制PPM1A導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，高濃度的Cd2+可以通過增加氧化應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+和Ni2+可以激活PPM1A和PPM1G;Cd2+、Zn2+、Hg2+、Ca2+、Sr2+、Cr2+、Ba2+可以抑制PPM1A和PPM1G。
　　2.鎘是PP2C有效的抑制劑，這一抑