人細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白的重組表達(dá)及在牙本質(zhì)形成中的作用和機(jī)理研究.pdf

1、MEPE，又名成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞因子45（Osteoblast/OsteocyteFactor45；OF45）或是Osteoregulin。2000年，Rowe在篩選腫瘤性低血磷性骨軟化癥（oncogenichypophosphatemicosteomalacia，OHO）患者腫瘤組織cDNA文庫(kù)中表達(dá)上調(diào)的基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了MEPE。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常組織中，MEPE在骨髓和大腦中表達(dá)，肺、腎和胎盤中的表達(dá)水平很低。同年，Peter

2、sen等在大鼠骨髓源性的成骨細(xì)胞中克隆到MEPE基因，Northernblot和免疫組織化學(xué)研究顯示：MEPE僅在骨組織中表達(dá)，特別是骨小梁和皮質(zhì)骨中的骨細(xì)胞呈高表達(dá)。2003年，Gowen等克隆了小鼠MEPE基因，發(fā)現(xiàn)其上游存在三個(gè)蛋氨酸密碼子，可以選擇性轉(zhuǎn)錄起始，最大可編碼441個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。Northern和Westernblot顯示MEPE在骨組織和成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。目前在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域MEPE的研究還是處于初期，對(duì)于M

3、EPE的功能我們還知之甚少。前期研究提示MEPE可能參與牙本質(zhì)形成。本課題通過MEPE基因克隆、原核以及真核蛋白表達(dá)等方法，在mRNA和蛋白質(zhì)的水平上，從MEPE的表達(dá)、在牙齒細(xì)胞中功能以及在羥基磷灰石晶體形成和生長(zhǎng)中作用等幾個(gè)方面，全面深入地研究MEPE參與牙本質(zhì)基質(zhì)形成和礦化的過程、作用和機(jī)理等。這將闡明MEPE在牙本質(zhì)牙髓復(fù)合體形成和損傷修復(fù)中的機(jī)制，豐富牙髓生物學(xué)和牙齒發(fā)育生物學(xué)，并為臨床上生活牙髓的保存治療和組織工程化牙本質(zhì)修

4、復(fù)牙體組織缺損提供理論基礎(chǔ)
　　本研究分為以下5個(gè)部分內(nèi)容：
　　一、MEPE基因克隆和序列分析
　　利用PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物從人腦cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出MEPE編碼區(qū)基因片段(約1.5kb)，將擴(kuò)增的基因片段插入pGEM-TEasy克隆載體，限制性酶切進(jìn)行鑒定并進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。結(jié)果表明：克隆到人MEPE蛋白編碼區(qū)基因片段，序列與GenBank中收錄的人MEPEcDNA序列一致。
　　二、MEPE基因在原核

5、和真核細(xì)胞中的表達(dá)
　　將MEPE編碼區(qū)全長(zhǎng)片段亞克隆至表達(dá)載體pGEX-4T-1中，大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，純化后獲得人MEPE蛋白。以重組、純化的MEPE為抗原，混入完全/不完全弗氏佐劑，免疫新西蘭大白兔，制備MEPE多克隆抗體。
　　分別將MEPE基因亞克隆入非融合和融合真核表達(dá)載體pcDNA3.1和pEGFP-C3中，脂質(zhì)體介導(dǎo)將載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞COS-7，通過免疫組織化學(xué)、WesternBlot等方法檢測(cè)MEPE蛋

6、白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)表達(dá)的綠色熒光蛋白融合蛋白所發(fā)出的熒光位于細(xì)胞漿中，胞核中無(wú)熒光，與免疫組化結(jié)果一致，說(shuō)明MEPE位于細(xì)胞漿中。WesternBlot檢測(cè)顯示在COS-7細(xì)胞中表達(dá)的MEPE的分子量為61kDa，與理論值相符。
　　三、MEPE蛋白的組織表達(dá)特性研究
　　用制備的抗人MEPE蛋白抗體對(duì)狗牙胚組織切片進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞染色陽(yáng)性，前期牙本質(zhì)染色陽(yáng)性，牙髓細(xì)胞染色陰性。
　　四、

7、MEPE蛋白對(duì)牙髓細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞的生物學(xué)作用
　　采用四唑鹽比色法觀察了MEPE蛋白對(duì)人牙周膜細(xì)胞、牙髓細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEPE蛋白對(duì)牙周膜細(xì)胞增殖無(wú)促進(jìn)作用、對(duì)牙髓細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。酶動(dòng)力學(xué)方法觀察了MEPE蛋白對(duì)人牙周膜細(xì)胞、牙髓細(xì)胞ALP活性的影響。研究結(jié)果表明，MEPE蛋白可提高牙髓細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞的ALP活性。Vonkossa染色結(jié)果顯示MEPE蛋白可促進(jìn)牙髓細(xì)胞的體外礦化。
　　五、采用穩(wěn)態(tài)瓊脂糖凝