磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN在心肌細胞外基質(zhì)重構(gòu)中作用的研究.pdf

1、研究背景： 心肌重構(gòu)包括心肌細胞重構(gòu)與胞外基質(zhì)重構(gòu)，是各種心臟病發(fā)展為心力衰竭過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。研究表明，細胞外基質(zhì)處于活躍的代謝狀態(tài)，并且積極地參與細胞內(nèi)外信息傳遞與心臟結(jié)構(gòu)和功能的維護。心肌細胞外膠原纖維網(wǎng)主要包含Ⅰ、Ⅲ型膠原，在正常生理條件下處于合成與降解的相對穩(wěn)態(tài)，這種平衡的維持主要與心臟成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成分泌與參與膠原降解的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)對膠原的降解基本保持一致有關(guān)，金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP

2、s)對MMPs的活性具有抑制作用，在ECM的代謝過程中也發(fā)揮了重要作用。在血管緊張素Ⅱ刺激下，可出現(xiàn)成纖維細胞的病理性增生，膠原合成增加以及MMPs/TIMPs活性改變造成的膠原降解的下降，從而使心肌細胞外基質(zhì)的降解與合成平衡被打破，導致膠原沉積，進而引起細胞外基質(zhì)重構(gòu)，最終導致心肌僵硬度增加，心臟舒張及收縮功能受損。因此抑制心臟成纖維細胞的增殖及膠原表達，防止膠原的沉積是預防和治療心肌細胞外基質(zhì)增生重構(gòu)的主要目標。 PTEN(

3、10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物)是一種腫瘤抑制因子，負性調(diào)控P13K/Akt信號通路，參與了細胞增殖、生長、分化、定向運動和凋亡等多種生物過程，對細胞外基質(zhì)合成與降解也具有調(diào)控作用。在腫瘤細胞中PTEN過度表達可導致細胞周期阻滯，抑制細胞增殖，同時抑制MMPs表達，細胞外基質(zhì)降解減少，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。但在原發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的研究中則發(fā)現(xiàn)，PTEN過度表達將減輕纖維化程度。這說明PTEN有可能抑制組織纖維化，其機制與抑制腫瘤

4、細胞轉(zhuǎn)移不盡相同。因此可以推測PTEN的過度表達將有可能抑制心臟間質(zhì)纖維化，但目前尚未見這方面的研究報道。 本實驗探討PTEN過度表達對血管緊張素Ⅱ刺激所致心臟成纖維細胞增殖及膠原合成與降解的影響，以期進一步了解PTEN在心肌細胞外基質(zhì)重構(gòu)中的作用及其機制。 研究方法： 1．鑒定并通過反復感染293細胞，擴增攜帶野生型PTEN基因的腺病毒載體(Ad-PTEN)，以及G129E(喪失了脂質(zhì)磷酸酶活性，僅保留蛋白磷酸

5、酶活性的PTEN突變體)基因的腺病毒載體(Ad-G129E)。 2．通過病毒感染構(gòu)建過度表達PTEN或G129E的心臟成纖維細胞模型，通過追蹤綠色熒光蛋白(GFP)的表達，檢測不同感染倍數(shù)(M.O.I.)的感染效率，以及感染后24h，48h和72h時GFP表達陽性率，確定合適的感染倍數(shù)和病毒表達時間。 3．用RT-PCR和Westem Blot檢測受感染細胞內(nèi)PTEN或G129E的mRNA和蛋白表達，檢測通過腺病毒感染介

6、導能否有效地引起心臟成纖維細胞內(nèi)過度表達PTEN或G129E。 4．用AngⅡ作為促心臟成纖維細胞分裂增殖及膠原合成的刺激劑，觀察PTEN或G129E過度表達對心臟成纖維細胞分裂增殖及膠原合成的影響，Ⅰ、Ⅲ型膠原，MMP-2，TIMP-1，TGF-β1作為膠原合成與降解的指標，僅攜帶GFP的空病毒(Ad-GFP)作為對照。 5．流式細胞儀檢測細胞周期，AO/EB法檢測細胞凋亡。 6．RT-PCR檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原，

7、MMP-2，TIMP-1，TGF-β1表達，Western Blot檢測Akt、P27蛋白表達，3H-脯氨酸摻入法檢測膠原合成率，明膠酶譜法檢測明膠酶活性。 結(jié)果： 1．鑒定已構(gòu)建好的Ad-PTEN及AD-G129E病毒載體，通過反復感染293細胞，通過反復感染AD293包裝細胞，腺病毒得到擴增，獲得較高滴度的病毒液。 2．Ad-G129E的轉(zhuǎn)染將引起心臟成纖維細胞失巢性凋亡。 3．Ad-PTEN和Ad-

8、GFP感染心臟成纖維細胞后，GFP表達陽性率隨著M.O.I.和時間增加而增加；M.O.I.達到100以上時，細胞GFP陽性率達到90％以上；各種M.O.I.感染48h后，GFP陽性表達趨于穩(wěn)定，因此確定M.O.I.100感染后48h作為進行后續(xù)實驗的適宜條件。 4．RT-PCR和Western Blot檢測顯示，攜帶外源基因PTEN的腺病毒感染后，心臟成纖維細胞內(nèi)過度表達PTEN的mRNA和蛋白。 5．AngⅡ刺激使TG

9、F-β1表達顯著升高，抑制PTEN表達，激活PI3K/Akt通路，抑制P27蛋白表達，促使心臟成纖維細胞分裂增殖加速：PTEN過度表達抑制PI3K/Akt通路，促進P27蛋白表達，使心臟成纖維細胞出現(xiàn)細胞周期G1/S期阻滯，從而引起細胞增殖受抑制。 6．AngⅡ刺激使Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達及蛋白合成率均顯著升高，PTEN過度表達能夠抑制AngⅡ刺激所致Ⅰ、Ⅲ型膠原基因表達水平的升高，對Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的合成有顯著的抑制作用。

10、 7.AngⅡ刺激使MMP-2以及TIMP-1 mRNA表達顯著升高，PTEN過度表達時AngⅡ刺激將導致MMP-2 mRNA表達的下降以及TIMP-1mRNA表達水平的升高。 8.AngⅡ刺激使心臟成纖維細胞分泌的明膠酶活性顯著降低，PTEN過度表達能明顯抑制心臟成纖維細胞分泌的明膠酶活性，但在AngⅡ刺激48h后明膠酶活性顯著增強，72h后這種增強效應(yīng)更加顯著。 結(jié)論： AngⅡ刺激促進心臟成纖維細胞T

11、GF-β1表達，從而抑制PTEN表達，PTEN表達的下調(diào)解除了對P13K/Akt信號通路的抑制，引起CDKs抑制因子P27表達下降，促進細胞分裂增殖；PTEN過度表達抑制了P13K/Akt通路，導致P27表達升高，細胞周期發(fā)生G1/S期阻滯，引起細胞增殖受抑；PTEN過度表達抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原基因轉(zhuǎn)錄和合成，AngⅡ刺激導致MMP-2轉(zhuǎn)錄水平下降以及TIMP-1轉(zhuǎn)錄水平的升高；PTEN過度表達能增加AngⅡ刺激后明膠酶活性，這種增強效應(yīng)呈