細胞外基質(zhì)在非小細胞肺癌中的表達及與凋亡和耐藥的關(guān)系.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分 細胞外基質(zhì)在非小細胞肺癌細胞株中的表達及與凋亡和耐藥之間的關(guān)系 背景及目的：肺癌已成為人類癌癥死亡的主要原因，第3代細胞毒性藥物聯(lián)合鉑類藥物組成的標(biāo)準(zhǔn)一線化療已為眾多腫瘤研究者所接受，但是耐藥問題卻始終是進一步提高化療療效的一大難題。既往的腫瘤耐藥機制不能完全解釋腫瘤細胞的耐藥現(xiàn)象。近來很多研究表明腫瘤微環(huán)境是產(chǎn)生耐藥的重要原因。其中細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM

2、)及其受體整合素在腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥中扮演著重要的角色。本文著重研究纖連蛋白(Fibronection，F(xiàn)N)、Ⅳ型膠原(Collagen Ⅳ，CⅣ)、層連蛋白(Lalninin，LN)等及受體整合素β<,1>(integrinβ<,1>，Intβ<,1>)在非小細胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)細胞敏感和耐藥株中的表達情況，并進一步了解與腫瘤細胞凋亡和耐藥的關(guān)系。 方法：體外培

3、養(yǎng)人肺腺癌細胞株A549及順鉑耐藥A549/DDP，采用細胞免疫組織化學(xué)方法，檢測A549敏感和耐藥株中ECM和Intβ<,1>的表達情況；應(yīng)用MTT比色法測定藥物敏感性和細胞增殖抑制率；通過細胞粘附實驗觀察細胞粘附狀況；流式細胞儀檢測順鉑作用前后C Ⅳ及PI3-K抑制劑LY294002對細胞凋亡和細胞周期的影響。 結(jié)果：細胞組織化學(xué)方法檢測A549敏感和耐藥株ECM表達水平時發(fā)現(xiàn)，A549敏感株不表達FN，低表達C Ⅳ和LN，

4、高表達integrinβ<,1>；而A549耐藥株則表達FN，高表達CⅣ，同樣低表達LN，高表達integrinpl，兩種細胞株表達的ECM存在差異。CⅣ組及多聚賴氨酸(polylysine，PLL)組與不包被組相比，兩種細胞粘附明顯增加(P<0.001)；而FN的粘附與不包被組相比無明顯差異(P>0.05)。C Ⅳ包被后順鉑對A549/DDP的IC<,50>由169.9μmol/l升高至258.3μmol/l，再聯(lián)合LY294002則

5、DDP對A549/DDP的IC50降至87.1mol/L；C Ⅳ明顯降低順鉑引起的兩種細胞株的凋亡，LY294002則可阻斷C Ⅳ的這種保護作用(均為P<0.05)：C Ⅳ改變了A549和A549/DDP紐胞株在順鉑或聯(lián)合LY294002作用后的細胞周期分布，相對于對照組均不同程度的出現(xiàn)G1期阻滯現(xiàn)象。 結(jié)論：A549敏感株和耐藥株表達不同的ECM；C Ⅳ可能參與NSCLC耐藥形成，整合素和P13．K信號通路可能是肺癌細胞受化療

6、藥物作用后的重要生存途徑，這條信號通路的啟動也許是肺癌細胞產(chǎn)生耐藥的原因之一。 第二部分 RNA干擾技術(shù)研究整合素在ECM粘附介導(dǎo)的耐藥機制中的作用 背景及目的：除I A期外，大部分NSCLC治療方案中都需要采用化療。目前，化療仍為肺癌主要的全身治療方法。但化療療效有限，急需尋找新的耐藥機制，本研究擬應(yīng)用RNAi技術(shù)來探討整合素在ECM粘附介導(dǎo)的耐藥機制中的作用。 方法：體外培養(yǎng)耐藥人肺腺癌細胞株A549及耐順鉑

7、細胞株A549/DDP，采用RNAi方法，轉(zhuǎn)染A549敏感和耐藥株后檢測IntfBl的表達情況及轉(zhuǎn)染前后兩種細胞株的生物學(xué)變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染A549及A549/DDP細胞株，同時設(shè)立未轉(zhuǎn)染的Plastic組，17-0空質(zhì)粒組，17-2質(zhì)粒組，在C Ⅳ包被或不包被情況下對順鉑增殖抑制率的變化。我們發(fā)現(xiàn)A549和A549/DDP細胞在C Ⅳ包被時空質(zhì)粒17-0組和17-2組細胞存活率均增加；加入DDP后A549細胞17-0組在PLL

8、和C Ⅳ組無明顯差異，17-2組在C Ⅳ組細胞存活率有所下降，A549/DDP細胞17-0組在有C Ⅳ時細胞生存率增加，17-2組無變化；PLL+C Ⅳ+DDP和CⅣ+LY+DDP在A549和A549/DDP細胞株相比時發(fā)現(xiàn)17-0組和17-2組細胞生存率均有所下降。以上說明兩種細胞在轉(zhuǎn)染后，失去了CⅣ保護時對DDP的抗拒，變得相對敏感；而增加LY294002后兩種細胞株均表現(xiàn)出存活率更為下降的現(xiàn)象，說明整合素β1與PI3-K信號途徑在

9、這個信號傳導(dǎo)過程中起到了一定的協(xié)同作用。 結(jié)論：整合素和P13．K信號通路可能是肺癌細胞受化療藥物作用后的重要生存途徑，這條信號通路的啟動也許是肺癌細胞產(chǎn)生耐藥的原因之一。 第三部分：ECM在NSCLC中的表達及與新輔助化療的關(guān)系和臨床意義 背景和目的：NSCLC化療療效常常因為耐藥而受到影響，腫瘤微環(huán)境是其產(chǎn)生耐藥的重要原因。其中ECM及其受體整合素在腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥中扮演著重要的角色。尤其是腫瘤微

10、環(huán)境中ECM的粘附和重構(gòu)更被認(rèn)為是腫瘤得以逃脫化療藥物攻擊的避難所。為進一步了解ECM及其受體在NSCLC中的表達情況及與臨床病理和預(yù)后的關(guān)系，本研究采用免疫組化方法對73例接受或未接受新輔助化療的NSCLC患者FN、C Ⅳ、LN和IntfBl的表達進行檢測，并結(jié)合臨床病理資料和隨訪資料，探討ECM與NSCLC生物學(xué)特征、新輔助化療與否和預(yù)后的關(guān)系。本文旨在探討ECM在73例NSCLC中的表達及與新輔助化療的關(guān)系和臨床意義。 方

11、法：免疫組化Envision法檢測新輔助化療組與對照組ECM的表達，并結(jié)合臨床和病理資料進行相關(guān)統(tǒng)計分析。 結(jié)果：單因素分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)N陰性表達的患者中位生存期為67月，而FN陽性表達為38月，兩者之間有統(tǒng)計學(xué)上顯著性差異(P=0.048)。新輔助化療組中LN陰性表達與高的臨床緩解率有關(guān)。COX比例風(fēng)險模型對新輔助化療組進一步多因素分析，發(fā)現(xiàn)病期是影響預(yù)后的指標(biāo)，F(xiàn)N和LN的陰性表達有可能影響患者的預(yù)后，但未達到統(tǒng)計學(xué)上顯著性差異