褪黑素對大鼠肝纖維化的保護(hù)作用及其對NF-кB活性的影響.pdf

1、目的：肝纖維化是慢性肝病共有的病理特征，其過程涉及到多細(xì)胞、多分子事件，最終導(dǎo)致膠原和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM).在狄氏間隙沉積，并能發(fā)展為不可逆性肝硬化。近年來的研究證實(shí)，肝纖維化在未進(jìn)入肝硬化之前，尚有逆轉(zhuǎn)可能。在此階段，如果處理得當(dāng)，肝硬化有可能避免。然而，目前尚無理想的治療肝纖維化藥物。因此，探討肝纖維化的機(jī)理，開發(fā)有效和毒副作用小的治療肝纖維化的新藥是目前研究的重要方向。目前有證據(jù)提示，氧化

2、應(yīng)激在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。褪黑素（N-acetyl-5-metyoxytryptamine，melatonin）是松果體分泌的一種激素，為強(qiáng)大的內(nèi)源性抗氧化劑，能清除氧自由基和中間活性體。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)顯示，在由黃樟素、脂多糖（LPS）、四氯化碳（CCl4）、缺血再灌注、淀粉狀蛋白質(zhì)、電離輻射等誘導(dǎo)的氧化損傷中，褪黑素具有保護(hù)細(xì)胞、組織和器官的作用。另外，褪黑素還通過提高谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD

3、)、谷胱甘肽(GSH) 這些潛在性的抗氧化劑的水平而間接發(fā)揮抗氧化作用。近年研究顯示，褪黑素具有減少纖維母細(xì)胞增殖、抑制膠原合成作用。但褪黑素對肝纖維化的保護(hù)作用研究尚少。核轉(zhuǎn)錄因子кB（Nuclear factor-kappaB，NF-кB）是由二聚體構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子家族，具有調(diào)控炎癥、免疫、創(chuàng)傷愈合、細(xì)胞生存、細(xì)胞功能等作用。生理應(yīng)激、氧化應(yīng)激、暴露于某些化學(xué)品均可導(dǎo)致NF-кB激活，進(jìn)而發(fā)揮其關(guān)鍵性的應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)作用。NF-кB過度

4、激活與許多疾病有關(guān)。近來NF-кB在肝臟疾病中的功能和調(diào)控受到關(guān)注，肝臟的損傷和纖維增生涉及到NF-кB的活化。NF-кB在肝纖維化中的確切作用尚不甚清楚，褪黑素對纖維化肝臟中NF-кB活性的影響及其后果未見系統(tǒng)研究。本課題在建立大鼠CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝纖維化模型基礎(chǔ)上，探討MEL對肝纖維化的抑制作用和可能機(jī)制。同時(shí)，探討NF-кB在CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝纖維化中的作用，以及MEL是否通過抑制NF-кB活性而發(fā)揮抗纖維化作用。

5、　　 方法：采用四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）制備SD大鼠化學(xué)性肝纖維化模型。所有大鼠隨機(jī)分為6組：正常對照組（normal control group，normal組，11只）、模型對照組（model control group，model組，20只）、CCl4＋N-乙酰－L-半胱氨酸組（NAC組，為陽性藥對照，20只）、CCl4＋低劑量褪黑素組（MEL1組，20只）、CCl4＋中劑量褪黑素組（MEL

6、2組，20只）、CCl4＋高劑量褪黑素組（MEL3組，20只）。將CCl4與精制花生油按2 ：3 比例配成40％CCl4油劑溶液，除正常對照組外，余按3ml/kg給大鼠皮下注射，每周兩次，連續(xù)12周，正常對照組注射等容量花生油作為對照。自動(dòng)物皮下注射CCl4之日起，開始給藥，NAC 100 mg/kg，I.p.，每天1次；MEL低、中、高劑量組分別給予MEL 2.5mg/kg、5mg/kg、10 mg/kg，均為腹腔注射。12周實(shí)驗(yàn)結(jié)束

7、后，所有動(dòng)物予以麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取出肝臟并稱濕重。HE染色和Van Gieson (VG)膠原纖維染色觀察肝臟病理改變；全自動(dòng)生化分析儀檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，A）、球蛋白(globulin，G)水平；生化法測定肝臟羥脯氨酸 (hydroxyproline ,Hyp)、丙二醛 (

8、malondialdehyde ,MDA)含量和谷胱甘肽過氧化物酶活性(glutathione peroxidase ,GPx)；放射免疫法測定血清透明質(zhì)酸（hyaluronic acid,HA）、層粘連蛋白（laminin,LN）、三型前膠原氨端肽（procollagen Ⅲ N-terminal peptide，PⅢNP）含量；免疫組化法測定肝組織中NF-кB P50、NF-кB P65、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosi

9、s factor-α，TNF-α）、細(xì)胞間粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM－1）的表達(dá)；RT-PCR法測定肝組織中Ⅰ型前膠原（procollagen typeⅠ）mRNA表達(dá)；電泳遷移率改變分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）測定肝組織中NF-кB DNA結(jié)合活性；同時(shí)，用原位灌注加密度梯度離心法分離正常SD大鼠肝臟星狀細(xì)胞，

10、以免疫組化法鑒定（用desmin抗體），在培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞中加入脂多糖（LPS）進(jìn)行刺激，用MTT法測定不同濃度的MEL對肝星狀細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　 結(jié)果：⑴通過12周皮下注射CCl4，成功建立了大鼠肝纖維化模型。病理分級顯示：正常對照組和CCl4處理各組之間差異顯著（P<0.01），和模型組相比，MEL(10 mg/kg)組肝纖維化程度較輕，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明MEL(10 mg/kg)有抑制肝纖維化作用。

11、與正常對照組比較，CCl4處理各組血清ALT、AST水平顯著升高（P<0.01），與模型組比較，MEL(5，10 mg/kg)能顯著降低升高的的ALT、AST水平（P<0.05，P<0.01），NAC也能顯著降低升高的ALT、AST水平（P<0.05），其作用強(qiáng)度和MEL相近。同樣，與模型組比較，MEL(10 mg/kg)能降低肝臟Hyp含量和LN、HA水平，表明MEL對纖維化標(biāo)志物的改善。另外，MEL對氧化應(yīng)激指標(biāo)也有明顯影響，和模型

12、組比較，MEL（5，10 mg/kg）能顯著降低肝勻漿MDA含量（P<0.05），升高GPx活性（P<0.05，P<0.01），NAC 也有同樣作用，其作用強(qiáng)度和MEL（10 mg/kg）相近。⑵通過原位灌注和密度梯度離心法成功分離并純化大鼠肝星狀細(xì)胞，剛分離的星狀細(xì)胞純化至70－80％，存活率在90％以上，純化的星狀細(xì)胞得率2×107/肝。傳第一代的細(xì)胞，S-P法作免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，Desmin表達(dá)陽性細(xì)胞為90％以上。與對照組（無L

13、PS刺激）相比，培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞經(jīng)LPS(10ng/ml)刺激后，增殖明顯加快，與LPS組相比，MEL(0.1mmol/L)能顯著抑制由LPS刺激的肝星狀細(xì)胞增殖。⑶正常對照組大鼠肝組織I型前膠原mRNA表達(dá)較少，和CCl4處理各組相比，差異顯著（P<0.05，P<0.01）。和模型組相比，MEL(10 mg/kg)組、NAC組表達(dá)明顯減少（P<0.05），MEL(2.5mg/kg，5mg/kg)表達(dá)有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果

14、表明MEL有抑制肝臟纖維化大鼠I型前膠原mRNA表達(dá)作用。⑷NF-кB P65、NF-кB P50在正常對照組大鼠肝組織中僅有微量表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿中淡黃色顆粒，較之正常對照組，CCl4處理各組表達(dá)明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為棕黃色和/或棕褐色顆粒，且細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均有表達(dá)，和模型組相比，MEL（5，10 mg/kg）、NAC均能顯著降低NF-кB P65、NF-кB P50的表達(dá)。進(jìn)一步，NF-кB DNA結(jié)合活性被測定，結(jié)果顯示，正常對照組N

15、F-кB結(jié)合活性較弱，模型組NF-кB結(jié)合活性較其它各組明顯增強(qiáng)，和模型組相比，MEL能明顯抑制NF-кB的結(jié)合活性。TNF-α、ICAM-1在正常對照組大鼠肝組織中僅很微量表達(dá)，表現(xiàn)為細(xì)胞漿中淡黃色顆粒，較之正常對照組，CCl4處理各組表達(dá)明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為棕黃色和/或棕褐色顆粒，以血管周圍，匯管區(qū)炎性細(xì)胞較多的區(qū)域最為明顯，其表達(dá)強(qiáng)度弱于NF-кB P65、NF-кB P50，和模型組相比，MEL（10 mg/kg）、NAC均能顯著降

16、低TNF-α、ICAM-1的表達(dá)。
　　 結(jié)論：①連續(xù)12周CCl4皮下注射成功復(fù)制出大鼠肝纖維化模型，該模型具有典型肝纖維化病理表現(xiàn)，同時(shí)符合有關(guān)血液、肝組織生化檢查改變，適合藥物防治肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究。②MEL具有保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝纖維化作用，這種作用考慮與其抗氧化有關(guān)。③NF-кB與肝纖維化關(guān)系密切，其表達(dá)和DNA結(jié)合活性與肝纖維化程度一致，在肝纖維化的發(fā)展中起重要作用。④MEL保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝纖維化作用可能部分地與其抑