4-1BB-4-1BBL雙向信號在免疫調(diào)節(jié)中的作用及其分子機制.pdf

1、本文首先克隆了人全長4-1BBL分子，建立了4-18BL轉(zhuǎn)基因細胞，并以此為免疫原，成功研制了兩株具有不同抗原識別位點及功能的抗人4-1BBL單克隆抗體。在上述基礎上還探討了4-188／4-1BBL雙向信號對T細胞活化的調(diào)節(jié)作用及其分子機理，4-188／4-1BBL雙向信號在單核細胞分化發(fā)育中的作用及涉及的分子。進而，提出了4-1BB／4-18BL雙向信號介導免疫應答中單核細胞、DC和T細胞之間相互作用的新的模型假說。 一、人4

2、．1BBL分子的克隆、基因轉(zhuǎn)染細胞的構(gòu)建及其單克隆抗體的研制。 1.人4-1BBL基因的克隆和逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建。 根據(jù)4—1BBL基因(GeneBank：gi：24119163)序列，利用RT-PCR方法從活化T細胞中克隆了全長4-1BBL基因，通過基因克隆技術(shù)，將其插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term。進一步通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組表達載體與輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染包裝細胞293T，用其培養(yǎng)上清感染L929細胞72h

3、后，經(jīng)Zeocin篩選出穩(wěn)定表達4．1BBL分子的L929細胞株(L929／4．1BBL)。經(jīng)體外長期傳代和液氮反復凍存和復蘇，轉(zhuǎn)基因細胞生長良好，4。lBBL的表達穩(wěn)定在95％以上。 2.鼠抗人4-1BBL單克隆抗體的研制。 以L929／4．1BBL細胞作為免疫原，免疫Balb／c小鼠。采用B淋巴瘤雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠的脾臟和小鼠骨髓瘤細胞SP2／0進行融合，經(jīng)HAT篩選后，以FACS分析篩選陽性克隆，經(jīng)過3次亞克隆

4、及反復篩選，最終得到兩株持續(xù)分泌抗人4—1BBL單克隆抗體的雜交瘤細胞株(3Ell和2C7)，經(jīng)快速定性試紙分析，結(jié)果顯示，McAb3Ell和McAb2C7的Ig類別均為IgGl。經(jīng)體外長期培養(yǎng)和液氮凍存，復蘇的雜交瘤細胞生長良好，穩(wěn)定分泌抗體。采用本室建立的腹水誘生和純化方案誘生腹水，3Ell，2C7腹水型單抗的效價>1：1000。3Ell和2C7腹水經(jīng)ProteinG親和層析分離純化，濃度為0．9—1．2mg／ml。純化后抗體蛋白用

5、于間接免疫熒光分析的用量為0．25-2．0μg/l×106細胞。 3.鼠抗人4-1BBL單克隆抗體生物學特性的研究。 為了研究McAb3E11和McAb2C7對4．1BBL分子表達細胞的識別和結(jié)合特性，選擇表達4．1BBL膜分子的U266、U937、Daudi和Jurkat，通過間接免疫熒光標記法及流式細胞儀(FCM)分析，結(jié)果顯示，McAb3E11和McAb2C7能特異性地識別不同細胞表達的4．1BBL分子。L929／

6、4-1BBL為競爭靶細胞，采用競爭抑制實驗分析3Ell和2C7的抗原識別位點。實驗結(jié)果表明，McAb3E11和McAb2C7與商品化4—1BBLMcAb識別的抗原位點不完全相同，且McAb3E11和McAb2C7之間的識別位點也不相同。因此，這兩株識別位點不同的抗體可以為研制可溶性4．1BBL的ELISA試劑盒奠定重要的物質(zhì)基礎。3H-TdR摻入法分析證實，McAb3E11與McAb2C7均能誘導單核細胞的體外增殖，且3E11具有更強的

7、促增殖效應。 二、4．1BB／4．1BBL雙向信號在T細胞活化調(diào)節(jié)中的作用。 首先動態(tài)檢測了4．1BB和4一lBBL分子在T細胞活化過程中的表達。FACS分析結(jié)果顯示，T細胞活化12h即可檢測到4．1BB在細胞膜上較高水平的表達，隨著時間的延長表達水平不斷提高，第3天時達高峰，隨后有逐趨下降，但仍維持較高水平的表達。而4—1BBL分子在第2天時才被檢測到在T細胞上開始表達，在第3天時達高峰，隨后有微弱下降趨勢，但仍維持一

8、定水平的表達。由此表明，活化T細胞可上調(diào)表達4．1BB和4．1BBL，并在活化的高峰期呈現(xiàn)共表達。 在此基礎上，探討了4．1BB／4．1BBL正向信號的對T細胞作用。3H-TdR摻入實驗結(jié)果顯示，L929／4．1BBL細胞較L929／mock細胞能有效地促進CD3McAb預活化的T細胞增殖。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清，結(jié)果顯示，在L929／4．1BBL的作用下，在T細胞的培養(yǎng)上清中IL-2和IFN-γ的分泌水平明顯上升，而且隨培

9、養(yǎng)時間的延長而增高。T細胞活化2d后，F(xiàn)ACS分析T細胞表型顯示，L929／4．1BBL下調(diào)活化T細胞表達CD95和PD．1。而且L929／4．1BBL還能協(xié)同CD28McAb促進T細胞活化。繼而，我們探討了4—1BB／4．1BBL逆向信號對T細胞的作用。細胞計數(shù)結(jié)果顯示，McAblFl(由于MoAb1Fl和McAb3E1l均可激發(fā)4．1BBL逆向信號，故文中只給出了采用MoAb1Fl的實驗結(jié)果，下同)可明顯抑制CD3McAb聯(lián)合CD2

10、8MeAb對T細胞的增殖效應。用AnnexinV和PI雙標記后，F(xiàn)ACS分析表明，McAb1Fl可誘導活化的T細胞發(fā)生大量凋亡。ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清結(jié)果顯示，McAb1Fl作用組T細胞分泌IL-2和IFN-γ的水平明顯低于對照組。T細胞經(jīng)McAb1F1刺激3d，用anti-CD95-PE和anti-PD．1．PE標記及FACS分析型顯示，T細胞上調(diào)表達CD95和PD-1。 三、4-1BB/4-1BBL逆向信號對單核細胞的效

11、應。 1.4-1BB／4-1BBL逆向信號對單核細胞的促增殖效應。 首先，3H-TdR摻入法分析人外周血單核細胞的體外增殖實驗證實，McAb1Fl能通過激發(fā)4．1BBL逆向信號促進表達4．1BBL的人外周血單核細胞的大量擴增。進而的實驗顯示，MeAb1Fl能促進單核細胞分泌細胞因子M-CSF、GM-CSF、FL和IL-6等。由此推測，4．1BBL逆向信號可能是通過促進單核細胞分泌的這些細胞因子的協(xié)同作用介導了單核細胞的增

12、殖。進而，我們探討了4．1BBL逆向信號通路的分子機制。業(yè)已證實，4—1BBL分子的胞漿段僅14個氨基酸但存在CKl激酶的磷酸化位點，由此推測4．1BBL逆向信號的傳導可能與CKl激酶有關(guān)。3H-TdR摻入法分析證實，CKl激酶抑制劑IC261能顯著抑制MeAb1Fl誘導的單核細胞的體外增殖。采用激光共聚焦顯微鏡觀察到經(jīng)MeAb1Fl作用的單核細胞30min后，胞漿NF-κB產(chǎn)生核轉(zhuǎn)位，60min后大部分NF-κB分子已從胞漿轉(zhuǎn)移到核內(nèi)

13、，而IC261能顯著抑制McAb1Fl誘導的NF—KB核轉(zhuǎn)位。這些實驗結(jié)果提示，在介導單核細胞增殖的4．1BBL逆向信號通路中，4．1BBL的CKl磷酸化和NF．KB核轉(zhuǎn)位存在關(guān)聯(lián)性。 2.4-1BB／4-1BBL逆向信號在單核細胞向Mo-DC分化誘導中的作用。 在上述實驗基礎上，進一步探討抗體介導的4．1BBL逆向信號對人外周血單核細胞分化為DCs的作用。結(jié)果顯示，McAb1Fl能協(xié)同IL-4誘導單核細胞分化發(fā)育為Mo

14、-DC，并且，McAb1Fl介導的逆向信號在Mo-DC的形成過程中起到了類似GM-CSF的作用即促進Mo-DC的有效增殖。McAb1Fl促進Mo-DC增殖的機制的初步研究表明，抗體介導的逆向信號能誘導Mo-DC分泌高水平的細胞因子M-CSF、GM-CSF和FL，這些細胞因子的阻斷性抗體均能分別部分阻斷McAb1Fl對Mo-DC的促增殖效應，抗體的聯(lián)合運用則可完全阻斷McAb1F1介導的Mo-DC增殖效應。 在單核細胞分化和發(fā)育為

15、Mo-DC的過程中，4-1BBL逆向信號還能促進Mo-DC的成熟及調(diào)節(jié)Mo-DC的功能，有效地上調(diào)MoDC對CD86、CD83和MHCII的表達，下調(diào)CDl4的表達。4．1BBL逆向信號還能改變其他膜分子的表達，如下調(diào)PD-L1的表達。McAb1Fl協(xié)同IL-4培養(yǎng)的Mo-DC吞噬能力顯著下降，這也表明4．1BBL逆向信號具有促進Mo-DC成熟的作用。進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，4．1BBL逆向信號促進TNF．Q、IFN—Y、IL．12和IL-6

16、的分泌及抑制IL一10的分泌，TNF-α、IFN．Y分泌的增加和IL-10分泌的減少可能是4．1BBL逆向信號促進Mo-DC成熟的重要原因。4．1BBL逆向信號還能促進Mo-DC分泌趨化因子MCP．1、MIP-α、MIP-β、MDC及IL-8等，這些趨化因子介導了DC和其他免疫細胞如單核細胞和T細胞的遷移效應。而且采用McAb1Fl協(xié)同IL-4誘導單核細胞形成的DC激發(fā)T細胞的功能明顯強于常規(guī)方法誘導培養(yǎng)的Mo-DC。其機制可能是4．1

17、BBL逆向信號誘導的Mo-DC分泌高水平的細胞因子，上調(diào)表達CD86、CD83、MHCⅡ及下調(diào)表達PD-L1分子，通過這些分子的聯(lián)合作用提高了Mo-DC對T細胞共刺激作用。上述研究結(jié)果表明，McAbIFl聯(lián)合IL-4培養(yǎng)的Mo-DC具有潛在的臨床應用價值，為解決制約DC在腫瘤免疫治療中應用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)一獲得大量功能性的DCs--提供了一條新的途徑。 總結(jié)以上研究結(jié)果及國內(nèi)外其他學者的相關(guān)報道，提出了4．1BB／4—1BBL雙向信號