2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:
  T細胞免疫球蛋白域與黏蛋白域(T-cell immunoglo bulindo main and mucindomain,TIM)家族是近年來新發(fā)現(xiàn)的的一個基因家族,參與多種免疫免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展。人類TIM家族包括三個成員,分別是TIM-1、TIM-3、TIM-4。TIM-4區(qū)別于TIM-1、TIM-3的關(guān)鍵點在于其選擇性表達于抗原提呈細胞表面,特別是活化的樹突狀細胞以及巨噬細胞表面。近期文獻報道,TIM-4

2、可表達于DC來源的惡性腫瘤、惡性組織細胞肉瘤以及朗格漢斯細胞肉瘤,另有病例報告顯示咽旁脂肪肉瘤中也可檢測到TIM-4的表達。
  肺癌是一種高發(fā)病率及高致死率的常見惡性腫瘤,2014年最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,肺癌已經(jīng)成為全球致死率最高的腫瘤,而其發(fā)病率也高居第二位。課題組前期研究表明,TIM-4在人非小細胞肺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織,其在肺癌組織中的表達水平與腫瘤分化程度顯著負相關(guān),且與腫瘤病人存活時間密切相關(guān)。文獻報道,TI

3、M-4IgV域具有可與整合素結(jié)合的Arg-Gly-Asp(RGD)基序,提示TIM-4可能具備一定的黏附功能。另外,TIM-4胞內(nèi)段無酪氨酸活化基序,無法直接介導信號轉(zhuǎn)導。那么,高表達的TIM-4在肺癌進展中發(fā)揮怎樣的作用?其作用機制如何?本研究將利用細胞及動物模型探索TIM-4在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用及相關(guān)效應(yīng)機制。
  TIM-4是TIM-1的天然配體,TIM-4與TIM-1相互作用可為T細胞提供協(xié)同刺激信號,促進T細胞活化

4、增殖,也有研究表明TIM-4對T細胞活化呈雙重調(diào)控效應(yīng)。TIM-4還可促進Th0細胞向Th2方向分化,TIM-4的多態(tài)性可能影響其與Tim-1的結(jié)合,打破對Th1/Th2細胞平衡的調(diào)控,進而導致哮喘及過敏性鼻炎的發(fā)生。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),TIM-4可負調(diào)控巨噬細胞的活性,顯著減輕ConA誘導的免疫性肝炎。另外,TIM-4可特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸,通過其IgV域的FG-CC'環(huán)識別凋亡細胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸介導巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬

5、,而凋亡細胞的清除障礙與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。TIM-4缺陷小鼠出現(xiàn)T細胞和B細胞過度活化,凋亡小體清除障礙,自身抗體產(chǎn)生等自身免疫病樣癥狀,TIM-4和乳脂球蛋白表皮生長因子8((milk fat globule EGFfactorⅧ,MFG-E8)同時敲除可促進自身免疫病的進展。最近文獻報道,TIM-4對于小鼠類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病具有雙重性,并將TIM-4作為治療關(guān)節(jié)炎的候選靶點。實驗室前期研究結(jié)果表明,系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Sy

6、stem icLupus Erythematosus,SLE)病人外周血單個核細胞中TIM-4mRNA的表達水平顯著高于正常人,且SLE患者TIM-4表達水平與疾病活動狀態(tài)相關(guān)。那么TIM-4在SLE這一典型自身免疫病中究竟扮演什么角色呢?本研究利用SLE動物模型初步探討了TIM-4在SLE進展中的作用。
  研究目的:
  闡明TIM-4在肺癌發(fā)生、進展中的作用及相關(guān)機制,為肺癌預防、診斷和治療提供新的候選靶點;初步探討T

7、IM-4在SLE進展中的作用,為自身免疫性疾病的發(fā)病機制研究提供新的思路。
  方法:
  1.免疫組織化學染色
  利用免疫組化試劑盒,對多器官組織芯片或裸鼠瘤體組織石蠟切片進行免疫組織化學染色,檢測包括食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、腎癌、肺癌在內(nèi)的多器官腫瘤及癌旁組織和裸鼠皮下移植瘤組織中TIM-4的表達情況。
  2.RT-PCR
  收集人肺癌細胞系A(chǔ)549、H1299、H35

8、8、H1975、SPCA1、95D以及人單核細胞系THP1,Trizol提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板,分別擴增TIM-4及actinmRNA。同法檢測A549細胞中整合素亞基αⅤ、β3mRNA的表達。
  3.載體構(gòu)建
  以pcDNA3.0為骨架載體,以pcDNA3.0-hTIM-4為模板,構(gòu)建攜帶HA標簽的人TIM-4全基因表達載體pcDNA3.0-hTIM-4-HA,再以此全長載體為模板,構(gòu)建IgV域RGD基

9、序突變?yōu)锳AA的hTIM-4突變載體pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA,以及PS結(jié)合位點第119、120、121、122位氨基酸全部突變?yōu)楸彼岬耐蛔冚d體pcDNA3.0-hTIM-4(119-122mutant)-HA,以PCR、雙酶切、測序鑒定載體。
  4.CCK-8檢測細胞增殖
  將pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA載體以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入A549細胞,CCK-8法檢測細胞

10、增殖,讀取OD450nm/630nm,繪制生長曲線;將人TIM-4三種小干擾RNA及對照分別轉(zhuǎn)入A549細胞,同上檢測細胞增殖、繪制生長曲線;pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三種載體分別轉(zhuǎn)入A549細胞,轉(zhuǎn)染后5天,CCK-8檢測細胞增殖。
  5.細胞周期檢測
  pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM

11、-4(RGD-AAA)-HA三種載體分別轉(zhuǎn)染入A549細胞,48h后PI染色,流式細胞術(shù)檢測細胞周期。同上轉(zhuǎn)染小干擾及對照后檢測細胞周期。
  6.凋亡檢測
  pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(119-122mutant)-HA轉(zhuǎn)染A549細胞,24h后更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基,進行血清饑餓以誘導凋亡,48h后收集細胞進行Annexin/PI雙標,流式細胞術(shù)檢測細

12、胞凋亡。
  7.WesternBlot檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、周期蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白A549細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三種載體,轉(zhuǎn)染48h后收蛋白,WesternBlot檢測PCNA、CyclinA、CyclinB1、CyclinD1的表達。A549細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0

13、-hTIM-4(119-122mutant)-HA,同上檢測Nur-77、PARP、Bcl2、Caspase-3、Caspase-9、Cytochromec的表達。
  8.免疫共沉淀(Co-IP)
  A549細胞種于6孔板中,轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-hTIM-4-HA,48h后收蛋白,分別用HA和αⅤβ3的抗體沉淀蛋白,WesternBlot檢測HA和αⅤβ3,驗證TIM-4和αⅤβ3可以相互結(jié)合。
  9.EdU免

14、疫熒光檢測細胞增殖
  A549細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三種載體,轉(zhuǎn)染后第4天進行EdU檢測,熒光顯微鏡下觀察。
  10.裸鼠成瘤實驗
  4-6w雄性BALB/c裸鼠,分為三組,皮下注射A549細胞,10d左右成瘤,待瘤體直徑長至5mm左右時開始瘤內(nèi)注射pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.

15、0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三種質(zhì)粒DNA,每間隔兩天注射一次,每次注射前量取瘤體長和寬,繪制生長曲線。14d后處死小鼠,剝離瘤體并稱量瘤重,拍攝瘤體照片,取少量腫瘤組織多聚甲醛固定,制作石蠟切片。
  11.SLE模型鼠的建立
  6-8wBALB/c雌性小鼠,腹腔注射pristane500μl,每月取血清測抗dsDNA抗體、ANA抗體,鑒定模型。
  12.Tim-4干預性處理
  小鼠腹腔注射p

16、ristine,1.5m后分為2組,分別尾靜脈注射lentivirusTim-4RNAi及Nc,同上每月檢測尿蛋白,取血清采用ELISA方法檢測抗dsDNA抗體、免疫熒光法檢測ANA抗體,pristane注射11月后處死小鼠,取血清,取腹腔巨噬細胞計數(shù),分離脾細胞進行流式檢測,腎臟和肺組織OCT包埋,進行冰凍切片。
  13.免疫熒光
  稀釋尾靜脈血清,免疫熒光檢測ANA;腎臟冰凍切片直接免疫熒光法標記IgG、C3抗體,檢

17、測腎臟免疫復合物沉積情況。
  14.流式細胞術(shù)檢測MDSC、Treg
  脾臟研磨制成單細胞懸液,標記CD11b、Gr1檢測MDSC;標記CD4、CD25、Foxp3檢測Treg。
  15.HE染色
  腎臟和肺冰凍切片進行HE染色,檢測腎臟和肺部炎癥損傷情況。
  結(jié)果:
  1.TIM-4在多器官腫瘤組織芯片中的表達
  多器官腫瘤組織芯片免疫組化檢測結(jié)果表明TIM-4表達于多種腫瘤組織

18、,其中食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌組織中TIM-4的表達明顯高于癌旁組織。
  2.LPS及細胞因子對TIM-4在肺癌細胞中表達的影響
  RT-PCR檢測結(jié)果顯示,多種肺癌細胞系A(chǔ)549、H1299、H358、H1975、SPCA1、95D中都可檢測到TIM-4mRNA的表達,但TIM-4表達水平較低;LPS、IL-6、TNF-α、TGF-β刺激可誘導TIM-4的表達。
  3.TIM-4對肺癌

19、細胞的生長及增殖的影響
  人TIM-4真核表達載體轉(zhuǎn)染A549細胞,利用CCK-8分別于不同時間點檢測細胞的生長情況,結(jié)果顯示TIM-4過表達組細胞生長速度顯著高于空載體對照組,Westernblot結(jié)果顯示PCNA表達顯著上調(diào),經(jīng)EdU染色,免疫熒光檢測結(jié)果顯示TIM-4過表達組細胞增殖顯著高于對照組。與此相對應(yīng),干擾TIM-4后可顯著抑制A549細胞的生長。
  4.TIM-4對肺癌細胞細胞周期的影響
  人TI

20、M-4真核表達載體轉(zhuǎn)染A549細胞,轉(zhuǎn)染后48h收集細胞,PI染色、流式細胞術(shù)檢測細胞周期。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TIM-4后可明顯促進A549細胞在S期累積,上調(diào)細胞周期蛋白CyclinA、CyclinB1、CyclinD1的表達;而轉(zhuǎn)染TIM-4siRNA后抑制A549細胞在S期積累。
  5.TIM-4與αⅤβ3在A549細胞中的結(jié)合
  RT-PCR結(jié)果顯示,A549細胞中可檢測到αⅤ、β3mRNA的表達,轉(zhuǎn)染pcDNA3-h

21、TIM-4-HA后分別以HA及αⅤβ3抗體進行Co-IP,結(jié)果顯示外源性TIM-4可與αⅤβ3相互結(jié)合。
  6.TIM-4RGD基序突變對A549細胞生長、增殖及細胞周期進展的影響分別轉(zhuǎn)染pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4(RGD-AAA)-HA,CCK-8、細胞周期、WesternBlot、EdU免疫熒光檢測結(jié)果顯示,TIM-4促進A549細胞生長、增殖及促細胞周期進展的作用消失。

22、>  7.TIM-4對Nur77表達及肺癌細胞凋亡的影響
  轉(zhuǎn)染TIM-4后,Annexin-Ⅴ/PI雙標,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,結(jié)果顯示TIM-4過表達抑制A549細胞的凋亡,WesternBlot結(jié)果顯示TIM-4轉(zhuǎn)染組Nur77表達降低,Bcl2表達升高,而PARP以及Cytochromec降低。
  8.TIM-4PS結(jié)合位點突變對A549細胞凋亡的影響
  分別轉(zhuǎn)染pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4

23、-HA、pcDNA3-hTIM-4(119-122mutant)-HA,Annexin-Ⅴ/PI染色,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIM-4PS結(jié)合位點突變載體抑制A549細胞凋亡的作用降低。
  9.TIM-4在體內(nèi)對肺癌生長的影響
  利用A549細胞接種于裸鼠進行皮下成瘤,分別瘤內(nèi)注射pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4(RGD-AAA)-HA質(zhì)粒DNA,通過測量腫瘤體積、

24、稱瘤重,發(fā)現(xiàn)野生型TIM-4質(zhì)粒注射組腫瘤生長速度明顯快于空載體對照組,而RGD基序突變質(zhì)粒注射組與對照組無顯著性差異。免疫組織化學染色結(jié)果顯示,pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4(RGD-AAA)-HA質(zhì)粒DNA注射組腫瘤組織中可檢測到較高水平的TIM-4表達,野生型TIM-4注射組Ki67表達明顯強于對照組,而RGD突變組與對照組無明顯差異。
  10.Pristane誘導SLE小鼠模型的建立

25、  通過定期檢測ANA抗體、抗dsDNA抗體證實小鼠SLE模型成功建立。Pristane腹腔注射后4周,腹腔中細胞數(shù)量明顯增加,外周血ANA檢測發(fā)現(xiàn)有不同的核型,包括均質(zhì)型、核少點型、核膜型。
  11.Tim-4慢病毒干擾對dsDNA、ANA、血清免疫復合物的影響
  Tim-4慢病毒干擾組及對照組血清dsDNA、ANA無顯著差別,血清循環(huán)免疫復合物檢測結(jié)果也無明顯差別。
  12.Tim-4干擾對腎臟IgG、C3免

26、疫復合物沉積的影響
  腎臟免疫熒光檢測結(jié)果顯示,TIM-4慢病毒干擾組IgG、C3免疫復合物沉積明顯多于對照組。
  13.Tim-4干擾對腎臟和肺損傷的影響
  腎臟、肺組織HE染色顯示,Tim-4慢病毒干擾加重腎臟和肺部炎癥損傷。
  14.Tim-4慢病毒干擾對腹腔巨噬細胞計數(shù)和脾臟MDSC、Treg的影響
  Tim-4慢病毒干擾組及對照組腹腔灌沈液巨噬細胞計數(shù)無差別,脾臟流式檢測MDSC、Tre

27、g無差別。
  結(jié)論:
  1.TIM-4可促進肺癌細胞的生長、增殖、細胞周期進展,抑制肺癌細胞的凋亡;
  2.TIM-4通過其IgV域RGD基序與整合素αⅤβ3相互結(jié)合促進肺癌細胞生長、增殖;
  3.TIM-4可能部分通過其PS結(jié)合位點抑制肺癌細胞凋亡,促進肺癌進展;
  4.TIM-4干擾加重SLE模型鼠腎臟免疫復合物沉積以及腎臟和肺部炎癥損傷。
  創(chuàng)新點及意義:
  本研究首次發(fā)現(xiàn)新

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