雌激素延緩衰老及植物雌激素α-ZAL抗Aβ細胞損傷作用的實驗研究.pdf

1、衰老的發(fā)生和演變是生物體不可抗拒的自然過程，隨著老年醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，有關(guān)衰老機制的學(xué)說已有上百種，但至今對衰老是如何發(fā)生的仍無確切答案。近年研究人員發(fā)現(xiàn)：伴隨自然衰老過程，活性氧產(chǎn)物生成增多超過機體清除能力，可致細胞及生物大分子受損，其中對核酸的損害主要表現(xiàn)為DNA氧化受損和修復(fù)不足，損傷DNA積累激發(fā)變異信號誘導(dǎo)性衰老，最終啟動衰老過程。減輕DNA損傷，促進損傷修復(fù)必然有利于衰老過程的延緩。作為一種內(nèi)源性激素，雌激素表現(xiàn)出的延緩自然衰

2、老的作用已被流行病學(xué)研究證實，但它對衰老過程中細胞DNA的損傷修復(fù)是否具有影響，尚未見相關(guān)報道。因此，本研究設(shè)計了體內(nèi)、外試驗，觀察衰老過程中雌激素作用下DNA損傷修復(fù)的變化，探討其可能的延緩衰老作用機制。 伴隨衰老進程，神經(jīng)退行性疾病-阿爾茨海默病(Alzheimers disease，AD)的發(fā)病率呈增高趨勢。在AD的發(fā)病中，β-淀粉樣蛋白(Aβ)的生成、代謝及毒性作用是AD發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。Aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡是AD神經(jīng)元丟失

3、的主要原因，因而拮抗Aβ誘導(dǎo)的細胞凋亡是預(yù)防AD的重要靶標。雌激素預(yù)防AD的作用已得到實驗的證實，但植物雌激素-α-玉米赤霉烯醇(α-Zearalanol，α-ZAL)是否具有類似效應(yīng)，迄今未見報道。本實驗設(shè)計以雌激素為陽性對照，觀察α-ZAL的抗Aβ?lián)p傷作用，在細胞水平評價α-ZAL的神經(jīng)保護作用，為開發(fā)新的安全有效的激素替代藥物奠定基礎(chǔ)。 第一部分雌激素減輕DNA氧化損傷，延緩衰老一、體外實驗1.應(yīng)用有限增殖細胞-人胚肺二倍

4、體成纖維細胞(human diploid fibroblasts，HDF)體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)以無E2血清培養(yǎng)的細胞經(jīng)50次群體倍增(PD50)后即完全進入衰老狀態(tài)，而從PD30開始加入E2(10-8、10-7、10-6)持續(xù)培養(yǎng)，細胞分別經(jīng)54、57、59次群體倍增后才進入完全衰老狀態(tài)，表明雌激素具有延長細胞生命周期的作用，且作用表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。 2.在PD50時，10-6M E2培養(yǎng)細胞中β-半乳糖苷酶染色陽性細胞數(shù)明顯

5、少于無E2培養(yǎng)對照細胞(P<0.05)。表明雌激素可延緩衰老表型的出現(xiàn)，有確實的抗衰老作用。 3.通過DCFH-DA免疫熒光染色觀察到，伴隨PD次數(shù)的增加，細胞內(nèi)源性ROS水平升高，而10-6M E2可以減緩該升高過程。表明雌激素可以促進活性氧產(chǎn)物的清除。 4.Western blotting實驗結(jié)果顯示，DNA損傷修復(fù)機制調(diào)控的重要因子p53和p21WAF1的表達受E2影響。在PD50時，10-6M E2培養(yǎng)細胞中p5

6、3和p21WAF1的表達低于對照細胞(P<0.05)，表明雌激素可明顯減少DNA損傷及其積累。 5.在PD50時，應(yīng)用流式細胞術(shù)分析細胞周期，發(fā)現(xiàn)10-6M E2培養(yǎng)條件下，細胞G1期細胞比例顯著低于對照組(P<0.05)；BrdU免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，10-6M E2培養(yǎng)細胞中BrdU陽性細胞數(shù)明顯高于對照細胞(P<0.05)，表明雌激素可以維持DNA復(fù)制，延遲細胞周期阻滯的出現(xiàn)。 6.單細胞凝膠電泳實驗結(jié)果顯示，

7、與200μM H2O2共孵育2h，細胞DNA明顯受損，細胞慧尾拉長，而H2O2作用后加入10-6M E2，細胞慧尾長度明顯短于單獨H2O2作用組(P<0.05)，表明雌激素可以明顯促進DNA損傷修復(fù)。 二、在體實驗 1.成年雌性C57小鼠隨機分為三組：對照組(Control)，假手術(shù)加皮下注射生理鹽水，腹腔注射芝麻油；模型組(Model)，雙側(cè)卵巢切除加皮下注射D-半乳糖100mg/kg.d和腹腔注射芝麻油；E2補充組(

8、ERT)，雙側(cè)卵巢切除加皮下注射D-半乳糖100mg/kg.d和腹腔注射E2 50μg/kg.d，D-半乳糖和E2連續(xù)使用8w。 2.MWM測試發(fā)現(xiàn)模型組小鼠尋臺潛伏期顯著長于對照組(P<0.01)，而ERT組小鼠尋臺潛伏期短于模型小鼠(P<0.05)，該結(jié)果顯示雌激素補充可明顯改善小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。 3.比色法測定腦海馬抗氧化酶活力及MDA含量。結(jié)果表明，與對照組小鼠相比模型組小鼠MDA含量顯著升高(P<0.01)

9、，抗氧化酶SOD及GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)，ERT組小鼠上述改變部分逆轉(zhuǎn)。 4.組織形態(tài)學(xué)表明，模型組小鼠海馬神經(jīng)元有明顯損傷，表現(xiàn)為海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏小體藍色顆粒減少和胞漿空泡樣變性，平均積分光密度值顯著低于對照組小鼠(P<0.01)，ERT組小鼠海馬CA1區(qū)尼氏小體增多，平均積分光密度值升高大于模型組小鼠(P<0.05)，表明雌激素可對抗D-半乳糖所致的神經(jīng)元損傷。 5.免疫組織化學(xué)及wester

10、n blotting結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬神經(jīng)元DNA明顯受損，海馬CA1區(qū)DNA氧化損傷標志物8-oxox-dG陽性細胞數(shù)顯著高于對照組小鼠(P<0.01)，而DNA損傷堿基切除修復(fù)蛋白MTH1及促DNA修復(fù)蛋白BDNF的表達均明顯降低(P<0.01)；ERT組小鼠CA1區(qū)8-oxox-dG陽性細胞數(shù)明顯減少， MTH1及BDNF的表達明顯回升(P<0.05)。同時，ERT組小鼠應(yīng)激誘導(dǎo)的促DNA修復(fù)蛋白Hsp70的表達亦顯著高于模

11、型組(P<0.01)，表明雌激素可通過調(diào)節(jié)DNA修復(fù)機制來減少DNA氧化損傷。 6.末次注射BrdU后24h，模型小鼠海馬DG區(qū)BrdU陽性細胞數(shù)較對照組顯著減少(P<0.01)，ERT組小鼠BrdU陽性細胞數(shù)明顯多于模型組(P<0.05)，表明雌激素可保護小鼠海馬區(qū)神經(jīng)干細胞的增殖，有利于衰老細胞更新，延緩組織老化。 7.利用形態(tài)學(xué)及RT-PCR的方法，觀察小鼠子宮的相關(guān)變化，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠子宮顯著萎縮，E2補充后子宮

12、重量增加，但子宮內(nèi)膜癌標志物MN/CA9 mRNA的表達在各組小鼠均未檢測到。表明在本實驗條件下雌激素使用在保護神經(jīng)元的同時未使子宮產(chǎn)生異常變化。 本部分研究結(jié)果顯示，雌激素可通過減少內(nèi)源性活性氧產(chǎn)物的生成，調(diào)控DNA損傷修復(fù)蛋白表達，減輕DNA氧化損傷，促進其損傷修復(fù)，從而減少由損傷DNA積累所啟動的衰老程序而發(fā)揮延緩衰老作用。 第二部分植物雌激素α-玉米赤霉烯醇對PC12細胞Aβ25-35損傷的保護作用研究1.培養(yǎng)P

13、C12細胞，采用MTT方法觀察到，5μM Aβ25-35與細胞共孵育24h，活細胞數(shù)顯著低于對照組(P<0.01)；而將細胞與不同濃度E2或α-ZAL預(yù)孵育12h后再加入Aβ25-35，活細胞數(shù)呈劑量依賴性的升高(P<0.05)，但在相同濃度下α-ZAL的細胞保護效應(yīng)略低于E2。 2.透射電鏡結(jié)果顯示，5υM Aβ25-35與PC12細胞共孵育24h可導(dǎo)致細胞凋亡。Hoechest33258熒光染色實驗結(jié)果顯示，Aβ25-35作

14、用組凋亡細胞數(shù)顯著多于對照組(P<0.01)，E2及α-ZAL預(yù)孵育均明顯減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的細胞凋亡(P<0.05)。 3.生化學(xué)檢測結(jié)果提示，與對照組相比，單獨Aβ25-35與PC12細胞共孵育，細胞MDA含量升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px活性降低(P<0.01)，而E2及α-ZAL預(yù)孵育均能有效對抗Aβ25-35所致的細胞抗氧化酶活性降低及MDA生成增多(P<0.01)，表明。E2及α-ZAL可明顯對抗Aβ

15、25-35導(dǎo)致的細胞氧化損傷。 4.Western blotting及RT-PCR實驗結(jié)果顯示，Aβ25-35導(dǎo)致PC12細胞抗凋亡蛋白be1-2表達減少，而促凋亡蛋白bax及caspase-3表達升高，E2及α-ZAL可拮抗上述改變。同時E2及α-ZAL還能誘導(dǎo)抗凋亡基因A20 mRNA的表達，表明E2及α-ZAL可通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白及基因的表達而發(fā)揮抗細胞凋亡作用。 本部分研究結(jié)果顯示，E2及α-ZAL均可通過對抗