中晚期原發(fā)性支氣管肺癌轉(zhuǎn)移血瘀證本質(zhì)及欖香烯對其的干預(yù)作用.pdf

1、肺癌的發(fā)病率與死亡率已逐漸占據(jù)各種疾病的首位。由于缺乏有效的治療手段，特別是不能很好地控制肺癌的轉(zhuǎn)移，常常導(dǎo)致治療的失敗。防止和阻斷轉(zhuǎn)移是肺癌治療取得成功的關(guān)鍵，也是國內(nèi)外肺癌研究的熱點和難點。近年來國內(nèi)外越來越重視癌癥的轉(zhuǎn)移和血瘀、活血化瘀之間的關(guān)系。綜合近年來研究進展及導(dǎo)師前期研究成果我們可以認為，中醫(yī)的“血瘀證”與腫瘤的轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，“血瘀證”可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的本質(zhì)之一。本研究就是在此認識的基礎(chǔ)上，探索中晚期肺癌這一死亡率極高(

2、其死因主要為轉(zhuǎn)移的發(fā)生)疾病的“血瘀證”的情況，探索活血化瘀藥對這一作用干預(yù)的可能靶點，以期進一步深化中醫(yī)對原發(fā)性支氣管肺癌轉(zhuǎn)移的認識。 1綜述部分1.1文獻綜述一　　通過對腫瘤轉(zhuǎn)移、血瘀證、及活血化瘀治療古代文獻及近二十余年來研究進展的系統(tǒng)回顧，進一步明確腫瘤轉(zhuǎn)移的“血瘀證”本質(zhì)及活血化瘀中藥對其的干預(yù)作用，并提出存在的問題及解決的策略。1.2文獻綜述二　　綜述有關(guān)肺癌中醫(yī)辨證分型的臨床與基礎(chǔ)研究現(xiàn)狀。總結(jié)了肺癌中醫(yī)分

3、型與肺癌國際TNM分期、病理分型、近遠期療效及蛋白質(zhì)和多肽、免疫學(xué)、血液流變學(xué)、微量元素等的關(guān)系。為肺癌中醫(yī)證型的研究提供了可借鑒的資料，提出肺癌中醫(yī)證型研究存在的問題及研究策略。 2臨床研究2.1 300例中晚期原發(fā)性支氣管肺癌血瘀證分布規(guī)律的調(diào)查研究　　通過為Ⅲ與Ⅳ期原發(fā)性支氣管肺癌患者填寫《原發(fā)性支氣管肺癌證型規(guī)律調(diào)查表》，觀察血瘀證在中晚期原發(fā)性支氣管肺癌中所占的比重及分布規(guī)律，分析血瘀證在不同病理類型的中晚期肺癌患

4、者中的分布；血瘀證在不同分化程度的中晚期肺癌患者中的分布；血瘀證在不同分期的中晚期肺癌患者中的分布；血瘀證在不同轉(zhuǎn)移部位的中晚期肺癌患者中的分布；血瘀證在合并不同中晚期肺癌常見并發(fā)癥患者中的分布；血瘀證在不同體質(zhì)狀況(KPS評分)的中晚期肺癌患者中的分布。結(jié)果顯示，隨著中晚期原發(fā)性支氣管肺癌病理類型惡性程度的增高，分化程度的變低，肝轉(zhuǎn)移、對側(cè)肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移、鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的發(fā)生，血瘀證構(gòu)成比有增高的趨勢。通過觀察血瘀證各主要癥狀及體

5、征在中晚期原發(fā)性支氣管肺癌患者中的出現(xiàn)頻率及分布規(guī)律，發(fā)現(xiàn)肺癌血瘀證有其獨特的特點，故我們對腫瘤?？粕踔练伟２《紤?yīng)建立能反映其疾病本身特點的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)甚至是量化、能分出輕重程度的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)，以更好的指導(dǎo)臨床診斷、療效評價以及中藥新藥的臨床試驗。2.2中晚期原發(fā)性支氣管肺癌患者與正常人血小板表面粘附蛋白表達異同的臨床觀察及意義　　采用流式細胞術(shù)檢測正常健康志愿者及中晚期原發(fā)性支氣管肺癌患者Ⅲ、Ⅳ期肺癌患者之間血小板表面粘附蛋

6、白CD36、TSP、CD63、CD62的表達狀況的不同，以觀察其血小板的激活的不同狀態(tài)。結(jié)果顯示肺癌患者CD36+TSP+、CD36+TSP-、CD63+CD62+、CD63-CD62+、CD63+CD62-血小板的數(shù)目高于正常人的表達，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)差異。同時肺癌患者CD36+TSP+血小板CD36表達的平均熒光道數(shù)及CD62+CD63+血小板CD63表達的平均熒光道數(shù)也高于正常人的表達，兩者比較有統(tǒng)計學(xué)差異。Ⅳ期肺癌患者CD36+

7、TSP-、CD63-CD62+、CD63+CD62+血小板的數(shù)目高于Ⅲ期患者，兩者比較有顯著性差異。CD62+CD63+血小板CD62及CD63表達的平均熒光道數(shù)Ⅳ期肺癌患者高于Ⅲ期患者，兩者比較有顯著性差異。從而可以認為，中晚期肺癌患者血小板呈廣泛激活狀態(tài)，與正常人比較有極顯著的差異。且中晚期原發(fā)性支氣管肺癌血小板激活狀態(tài)和腫瘤的分期及有無遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。進而可以認為“血瘀證”不單是原發(fā)性支氣管肺癌發(fā)生的機理之一，同時也是原發(fā)性支氣管肺

8、癌轉(zhuǎn)移的本質(zhì)之一。 3實驗研究3.1MTT法檢測欖香烯對PG、PAa細胞增值的抑制作用及PDGF-AB和TGF-β1對PG、PAa細胞增殖的影響　　MTT酶標(biāo)分析法檢測不同劑量欖香烯注射液對PG、PAa細胞增殖的抑制作用及不同劑量PDGF-AB和TGF-β1對PG、PAa細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，欖香烯對肺癌細胞系PG細胞和PAa細胞均有一定的抑殺作用，其對PG及PAa細胞的IC50分別約為75μg/ml和37.5μg/ml

9、。而主要由血小板分泌的兩種細胞因子PDGF-AB和TGF-β1對肺癌細胞系PG和PAa的增殖基本上無明顯的促進或抑制的作用。3.2欖香烯對肺癌細胞系表面所表達與侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的粘附蛋白的影響　　利用激光共聚焦顯微鏡觀察高轉(zhuǎn)移人巨細胞肺癌細胞PG和低轉(zhuǎn)移人肺腺癌細胞PAa表達的血小板免疫相關(guān)抗原CD42a、TSP、CD9的表達情況；利用流式細胞儀檢測的高轉(zhuǎn)移人巨細胞肺癌細胞PG和低轉(zhuǎn)移人肺腺癌細胞PAa表達的血小板免疫相關(guān)抗原CD42

10、a、TSP、CD9的表達情況及二種癌細胞與高、中、低濃度的欖香烯注射液共同孵育后CD42a、TSP、CD9的表達改變。結(jié)果顯示，利用激光掃描可見CD9、CD42a、TSP均勻的表達于細胞表面。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，PG細胞表達的CD9陽性細胞數(shù)目和平均熒光強度低于PAa細胞，而PG細胞表達的CD42a、TSP陽性細胞數(shù)目和平均熒光強度均高于PAa細胞，從而進一步印證了PG細胞系的轉(zhuǎn)移能力高于PAa細胞系。從總的趨勢來看，欖香烯注射液增高P

11、G和PAa細胞CD9的表達，降低其CD42a、TSP的表達，這可能是欖香烯注射液抗肺癌轉(zhuǎn)移的分子機理。3.3人肺癌細胞系PG、PAa對重組基底膜侵襲作用及欖香烯及PDGF-AB、TGF-β1對其的影響　　利用Transwell細胞培養(yǎng)小室觀察PG細胞和PAa細胞對重組基底膜的侵襲作用及高、中、低濃度的欖香烯注射液對這一作用的影響。觀察血小板激活后釋放產(chǎn)物PDGF(PDGF-AB)、TGF-β1與PG細胞和PAa細胞共同孵育后對它們侵

12、襲行為的影響，并觀察高、中、低濃度的欖香烯注射液對這個過程的影響。實驗結(jié)果顯示，PG的侵襲行為明顯高于PAa。從而顯示了兩種肺癌細胞系不同的侵襲特性，發(fā)現(xiàn)欖香烯注射液對PG及PAa細胞的侵襲均有明顯的抑制作用，從而說明欖香烯對肺癌細胞侵襲的干預(yù)作用。同時，實驗結(jié)果還顯示，PDGF-AB和TGF-β1能明顯促進PG和PAa細胞的侵襲行為，從一個側(cè)面進一步說明血瘀證和肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系，欖香烯對這一過程有明顯的抑制作用。參考前章MTT的結(jié)果，在