欖香烯和恩度對原發(fā)性肝癌細胞的凋亡和增殖的影響.pdf

1、原發(fā)性肝癌是肝癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一,具有惡性程度高、易復發(fā)、預后差的特點,手術切除是治療肝癌最有效的療法;但5年內復發(fā)率高達有60~70％。根據最新統(tǒng)計,全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬,居惡性腫瘤的第五位。原發(fā)性肝癌按細胞分型可分為肝細胞型肝癌、膽管細胞型肝癌及混合型肝癌。
　　欖香烯脂質體注射液是從姜科植物溫郁金中提取的抗癌有效成分。其主要生物學活性為降低腫瘤細胞有絲分裂能力,誘發(fā)腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞的生長。該藥

2、還能直接作用于細胞膜,使腫瘤細胞破裂,可以改變和增強腫瘤細胞的免疫原性,誘發(fā)和促進機體對腫瘤細胞的免疫反應。
　　恩度(endostatin)主要成分為重組人血管內皮抑制素,為國家一類新藥,作用于新生血管內皮細并抑制內皮細胞遷移,抑制腫瘤新生血管形成,阻斷腫瘤細胞營養(yǎng)供應,加速癌細胞凋亡過程。
　　目的:探討欖香烯和恩度對于肝癌細胞的增殖和凋亡的影響。
　　方法:1.噻唑藍還原法(MTT法)觀察欖香烯和恩度對HepG2

3、細胞活性的影響:分組為欖香烯20μl/ml、40μl/ml、60μl/ml、恩度50μl/ml、100μl/ml、150μl/ml、欖香烯加恩度20μl/ml+50μl/ml、40μl/ml+100μl/ml、60μl/ml+150μl/ml,和空白對照組。分別在96孔板里培養(yǎng)24h、48h、72h.胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞,以每空1×104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積200微升,將培養(yǎng)板適宜條件下,培養(yǎng)一天后分別加假如上述藥物

4、濃度,同時設立4個復孔和一個空白對照,之后每種濃度都分別培養(yǎng)24h、48h、72h后,每孔加入20μl的MTT溶液(5mg/ml),繼續(xù)在孵養(yǎng)4h,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內上清液,每孔加入150dsmo,震蕩2分鐘,使甲臜充分溶解。在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值,腫瘤細胞活性=實驗組光密度值/對照組光密度值×100%,計算各組活性。2.細胞周期檢測:分組為欖香烯20μl/ml、40μl/ml恩度50μl/ml、100μl/ml欖香烯聯

5、合恩度20μl/ml+50μl/ml、40ul/ml+100ul/ml。以每空1×106個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔體積1000μl,將培養(yǎng)板放入適宜條件下,培養(yǎng)一天后分別加入上述藥物濃度,同時設立空白對照,分別放在6孔板里培養(yǎng)24h。之后分用胰酶消化收集,用PBS洗一遍,保留50μl的殘液,其中的細胞數目大于1×105個;取細胞懸液50ul,加入到試管底部;加入100ul試劑A,與細胞懸液輕輕混勻,盡量避免產生氣泡,室溫孵育10mi

6、n;加入100ul試劑B于上述試管中,輕輕混勻,盡量避免產生氣泡,室溫孵育10min;加入150ul試劑C于上述試管中,輕輕混勻,盡量避免產生氣泡,室溫孵育15min;之后流式細胞儀分析。3.細胞凋亡檢測:分組為欖香烯20μl/ml、40μl/ml恩度50μl/ml、100μl/ml欖香烯聯合恩度20μl/ml+50μl/ml、40μl/ml+100μl/ml。以每空1×106個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中,每孔體積1000微升,將培養(yǎng)板放入

7、CO2孵箱,在CO2孵箱,適宜條件下,培養(yǎng)一天后分別加入上述藥物濃度,同時設立空白對照,分別放在6孔板里培養(yǎng)24h后終止培養(yǎng),之后分別用胰酶消化收集,用PBS洗兩遍(每一遍都離心),收集細胞,1-5×103個細胞;加入500μl的BindingBuffer懸浮細胞;加入5μlAnnexinV-FITC混勻后,加入5μlPropidiumIodide,混勻;室溫、避光、反應15min;之后立刻用流式細胞儀檢測,激發(fā)波長Ex=488nm,發(fā)

8、射波長Em=530nm.
　　結果:1.欖香烯對HepG2細胞有明顯的生長抑制作用,且隨著濃度和時間的增加,抑制呈增強作用,腫瘤細胞活性越低。濃度越高抑制作用越強,時間越長抑制越強。同時恩度(避光加藥)對肝癌細胞HepG2的作用也是同樣隨著濃度和時間的增加,抑制呈增強作用,腫瘤細胞活性減低。濃度越高抑制作用越強,時間越長抑制越強。兩者藥物聯合使用時有協(xié)同作用。所以說欖香烯和恩度對肝癌細胞都有明顯抑制生長的作用;同時使用時作用呈協(xié)同

9、性。2.欖香烯在肝癌腫瘤細胞周期中主要作用在G1期,因為在G1期細胞數目最多,可以理解為欖香烯把肝癌細胞阻止在G1期;恩度在肝癌細胞周期中在G1期細胞數目最多,說明主要作用在G2期,使肝癌細胞主要阻止在G2期。但是當欖香烯和恩度聯合使用時,G1期細胞最多,說明兩種藥物作用使可以細胞阻止在G1期;其實也有一個方面可以說ELE作用在腫瘤細胞的G1期,把細胞阻止在G1期,但之后的細胞數目不多,有恩度作用,G2期細胞比后面幾期數目多。3.欖香烯