炎癥因子和炎癥小體在漢坦病毒感染致病中作用的初步研究.pdf

1、腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever withrenal syndrome,HFRS)是由舊大陸漢坦病毒引起的,以急性腎功能損害為主要特征的急性傳染病。該病自從被發(fā)現(xiàn)報道以來,我國發(fā)病人數(shù)一直位于世界首位,每年報告病例數(shù)萬例以上,在我國的危害十分嚴(yán)重。目前,雖然已有滅活疫苗上市可供預(yù)防,但效果不佳,且臨床上還缺乏特異有效的治療藥物,只能以支持治療為主,因此HFRS至今仍是我國重點監(jiān)控和防治的傳染病。迄今HFRS的致病機(jī)制尚

2、不完全清楚,但HFRS引起的血管滲透增加、急性出血進(jìn)而引起休克等臨床表現(xiàn)提示,HFRS與炎癥因子誘導(dǎo)的血管通透增加之間存在聯(lián)系。此外,HFRS發(fā)病迅速,與細(xì)胞因子風(fēng)暴引起的疾病類似,即相關(guān)細(xì)胞因子的大量分泌和表達(dá)紊亂與疾病進(jìn)展密切相關(guān)。另外,固有免疫通路中的炎癥小體通路產(chǎn)生的IL-1β是一種強(qiáng)力的致熱原,可以介導(dǎo)多種炎癥反應(yīng)。而HFRS的起病即是高燒,我們推測IL-1β等致熱原可能在HFRS致病中起了一定作用。部分文獻(xiàn)也支持此項觀點,如

3、有報道稱HFRS病原體普馬拉病毒(PUUV)可以感染單核/巨噬細(xì)胞,漢灘病毒(HTNV)可以感染樹突狀細(xì)胞等,而這兩種細(xì)胞都可調(diào)節(jié)固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,并可大量分泌細(xì)胞因子,在宿主免疫系統(tǒng)抗擊病原的過程中起著十分重要的作用。此外,還有報道稱,HFRS患者體內(nèi)TNF-α等一系列細(xì)胞因子水平異常。有鑒于此,我們推測HFRS疾病進(jìn)程中,炎癥病理很可能起了十分重要的作用。
　　本研究首先檢測了HFRS患者不同病期血漿標(biāo)本中多種炎癥因子的水

4、平,之后利用實時定量PCR技術(shù)檢測了HTNV76-118株感染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)后,細(xì)胞中相關(guān)因子的mRNA水平;同時還檢測了HUVEC在HTNV刺激下,內(nèi)皮細(xì)胞中炎癥小體相關(guān)成分的mRNA水平和培養(yǎng)上清中炎癥小體通路產(chǎn)物IL-1β的水平,以初步明確炎癥在漢坦病毒感染致病過程中所起的作用。
　　1.HFRS患者外周血漿炎癥相關(guān)因子水平的檢測檢測了141例HFRS患者外周血漿中VEGF、sVEGFR1、sVEGFR2、s

5、VE-cadherin、IL-1β、S1P等相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況,同時以30例健康成年人血漿標(biāo)本為對照。檢測結(jié)果顯示,VEGF、sVE-cadherin等因子在疾病進(jìn)程中的水平與對照組相比有明顯的升高,且與疾病嚴(yán)重程度成正比。sVEGFR2的水平則與之相反,疾病的嚴(yán)重程度越高,其含量越低。健康人群中sVEGFR1基本檢測不到,而在休克期患者血漿中則可檢測到微量的sVEGFR1,提示其通路可能也在疾病中起了一定作用。在外周血漿中沒有檢測

6、到IL-1β和S1P。
　　2.HTNV感染HUVEC后,細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子mRNA水平變化情況以實時定量PCR檢測了HUVEC在HTNV76-118株感染后不同時間段(6h、12h、18h、24h等)的細(xì)胞裂解液中S1P受體(S1P1和S1P2)、VEGF、VEGFR2、VE-cadherin等因子的mRNA水平。結(jié)果顯示,VEGF、VEGFR2、S1P2的mRNA水平無明顯變化,而S1P1和VE-cadherin等因子的mRN

7、A水平在感染后期與感染早期相比有顯著升高。
　　3.HTNV感染HUVEC培養(yǎng)上清中IL-1β水平的測定以ELISA法檢測了HTNV76-118株感染HUVEC后不同時間點細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β的水平。結(jié)果顯示,在感染后早期(6h),相比未感染對照組,滅活的與未滅活的HTNV均可以刺激HUVEC產(chǎn)生更高水平的IL-1β;但隨著時間的延長,IL-1β的水平在三個組別中的含量有了相反的變化,即HTNV感染組與滅活病毒對照組相比未感染

8、對照組,其上清中IL-1β的水平很快下降并保持相對較低水平。說明HTNV的感染很可能是先激活炎癥小體,隨后又抑制了其通路的持續(xù)應(yīng)答。
　　4.HTNV感染的HUVEC中炎癥小體相關(guān)成分的檢測實時定量PCR結(jié)果顯示,未滅活與滅活的HTNV感染HUVEC細(xì)胞的裂解液,與未感染對照相比,早期都有IL-1β分泌水平的上升,但隨后又很快降為正常值。其他與炎癥小體相關(guān)分子,如NLRP3、caspase-1、ASC等的水平則沒有明顯變化,說明這

9、些成分的表達(dá)水平為常值,并不隨病毒感染而有明顯變化。未檢測到IL-18,但I(xiàn)L-18結(jié)合蛋白(IL-18BP)水平的變化與IL-1β類似。Western Blot的結(jié)果也顯示NLRP3和caspase-1等蛋白水平變化不明顯。
　　以上研究結(jié)果表明,HFRS患者中VEGF通路相關(guān)炎癥因子含量的變化與疾病進(jìn)程的嚴(yán)重程度密切相關(guān),佐證了炎癥在HFRS致病中起到了一定的作用。漢坦病毒可能存在激活炎癥小體通路的成分,而且可能是入胞前就刺激