PAI-1在肺泡上皮細胞炎癥因子表達和炎癥細胞趨化中作用的研究.pdf

1、目的：研究香煙煙霧提取物(CSE)及細菌成分脂多糖(LPS)刺激肺泡上皮細胞PAI-1表達在COPD炎癥過程中炎癥因子網絡形成和炎癥細胞趨化中的作用。
　　 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性氣道炎癥性疾病，以不完全可逆的氣流受限為特征，氣流受限呈進行性發(fā)展，是氣道對有害氣體或有害顆粒(特別是吸煙)的異常炎癥反應。纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)的主要抑制劑，除了其經典的纖溶功能以外，

2、還可以調節(jié)細胞黏附、運動和細胞因子水平，在機體免疫和炎癥及感染的控制方面有著重要作用。PAI-1可以調節(jié)細胞遷移，但其在細胞遷移中的作用是有爭議的，在不同的研究中，PAI-1顯示了抑制和促進細胞遷移兩種似乎矛盾的作用。PAI-1阻止ECM降解，抑制uPAR依賴的或整合素依賴的細胞黏附，阻斷尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)誘導的趨化。通過這些作用，PAI-1抑制細胞遷移。PAI-1通過促進細胞分離，調節(jié)趨化物質，及其本身具有的趨化作用來促

3、進細胞遷移。在體內實驗中，PAI-1還能夠調節(jié)某些細胞因子的水平。已證實PAI-1可以通過調節(jié)細胞因子的分布來影響細胞因子的水平，它能否直接影響細胞因子的表達有待進一步研究。前期研究顯示，PAI-1在COPD患者的誘導痰中表達明顯升高，且和肺功能重要指標FEV1％負相關，與重要炎癥因子IL-8水平正相關。這提示PAI-1在COPD的炎癥過程中扮演著重要角色，因此我們進行本研究來明確PAI-1在COPD炎癥中的作用。
　　 方法：

4、1.培養(yǎng)肺泡上皮細胞(A549細胞株)。2.根據(jù)Carp H.等的方法制備CSE。使用不同濃度的CSE和LPS刺激肺泡上皮細胞，ELISA檢測細胞上清中PAI-1表達情況，找出PAI-1表達高的最佳刺激濃度進行下續(xù)實驗。3.用RT-PCR檢測CSE或LPS刺激肺泡上皮細胞后PAI-1mRNA表達的變化，用western blotting及免疫細胞化學法檢測PAI-1蛋白表達。肺泡上皮細胞上清中的PAI-1及炎癥因子IL-8,LTB4的表

5、達使用ELISA檢測。分離人靜脈血中的單核細胞和中性粒細胞，進行checkerboard實驗和Transwell實驗，檢測CSE和LPS刺激的肺泡上皮細胞趨化炎癥細胞的情況。4.分別使用特異的針對PAI-1的3對siRNA轉染肺泡上皮細胞，RT-PCR檢驗干擾效率，選擇出干擾效率最高的一對siRNA。5.PAI-1干擾實驗分為以下6組：ncRNA空白組，ncRNA+CSE刺激組，ncRNA+LPS刺激組，siRNA空白組，siRNA+C

6、SE刺激組， siRNA+LPS刺激組。使用轉染效率最高的PAI-1特異的siRNA或陰性對照ncRNA轉染肺泡上皮細胞后，CSE或LPS刺激，使用RT-PCR，western blotting，ELISA，免疫細胞化學法檢測PAI-1的表達，ELISA檢測IL-8,LTB4的表達。Transwell小室法檢測特異性干擾肺泡上皮細胞PAI-1表達后炎癥細胞向其趨化的情況。6.用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩組之間比較采用成組設計

7、資料兩樣本均數(shù)的t檢驗。
　　 結果：1.ELISA結果顯示暴露于10％CSE與75μg/mlLPS48小時后，PAI-1表達顯著升高，且與其他濃度的CSE或LPS刺激產生的PAI-1有顯著差異。2.RT-PCR結果顯示，暴露于10％CSE或75μg/ml LPS的肺泡上皮細胞PAI-1mRNA表達明顯增加；western blotting顯示，暴露于10％CSE或75μg/ml LPS的肺泡上皮細胞PAI-1蛋白表達明顯增加；

8、免疫細胞化學結果顯示，肺泡上皮細胞在受到10％CSE或75μg/ml LPS刺激后，細胞形態(tài)與對照組基本一致，而PAI-1呈顯著增強的陽性表達； ELISA結果顯示細胞上清中PAI-1表達與對照組相比也顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，IL-8表達顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，LTB4表達顯著增加表達(P均＜0.01)。Transwell趨化實驗結果顯示單核細胞和中性粒細胞的趨化明顯加強，10％CSE刺激后分別是對照組的

9、2.8±0.1倍(P＜0.01)及2.45±0.12倍(P＜0.01)，75μg/ml LPS刺激后分別是對照組的2.25±0.1l倍(P＜0.01)及2.9±0.15倍(P＜0.01)。3.RT-PCR結果顯示，第三對PAI-1特異的siRNA具有最佳的干擾效率，PAI-1mRNA表達水平顯著降低。4.免疫細胞化學結果顯示，轉染ncRNA和siRNA的肺泡上皮細胞形態(tài)基本一致，ncRNA+CSE刺激組和ncRNA+LPS刺激組可見肺泡

10、上皮細胞與ncRNA空白組相比有增強的陽性表達，而siRNA空白組，siRNA+CSE刺激組和siRNA+LPS刺激組未見明顯的陽性表達。RT-PCR和western blotting結果顯示，通過使用PAI-1特異的siRNA，肺泡上皮細胞的PAI-1mRNA及蛋白表達都明顯抑制，在受到CSE和LPS刺激后，也未見明顯增加。ELISA結果顯示，上清中IL-8表達siRNA空白組明顯少于ncRNA空白組(P＜0.01)，siRNA+CS

11、E刺激組IL-8表達與ncRNA+CSE刺激組相比較，明顯減少(P＜0.05)。siRNA+CSE刺激組上清中LTB4表達顯著低于ncRNA+CSE刺激組(P＜0.01)，siRNA+LPS刺激組上清中LTB4表達顯著低于ncRNA+LPS刺激組(P＜0.01)。單核細胞和中性粒細胞的趨化在特異性干擾PAI-1表達后明顯減弱。單核細胞趨化siRAN+CSE刺激組與ncRNA+CSE刺激組相比，siRAN+LPS刺激組與ncRNA+LPS

12、刺激組相比，均明顯減弱(P均＜0.01)。中性粒細胞趨化siRAN+CSE刺激組與ncRNA+CSE刺激組相比，siRAN+LPS刺激組與ncRNA+LPS刺激組相比，也同樣顯著減弱(P均＜0.01)。
　　 結論：1.通過暴露于CSE和LPS，肺泡上皮細胞PAI-1、炎癥因子(IL-8與LTB4)表達被明顯誘導，炎癥細胞(單核細胞和中性粒細胞)被趨化。2.PAI-1是調節(jié)CSE和LPS刺激的肺泡上皮細胞IL-8和LTB4表達的