PAI-1在肺泡上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)和炎癥細(xì)胞趨化中作用的研究.pdf

1、目的：研究香煙煙霧提取物(CSE)及細(xì)菌成分脂多糖(LPS)刺激肺泡上皮細(xì)胞PAI-1表達(dá)在COPD炎癥過(guò)程中炎癥因子網(wǎng)絡(luò)形成和炎癥細(xì)胞趨化中的作用。
　　 慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種慢性氣道炎癥性疾病，以不完全可逆的氣流受限為特征，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，是氣道對(duì)有害氣體或有害顆粒(特別是吸煙)的異常炎癥反應(yīng)。纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)是尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)的主要抑制劑，除了其經(jīng)典的纖溶功能以外，

2、還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞因子水平，在機(jī)體免疫和炎癥及感染的控制方面有著重要作用。PAI-1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移，但其在細(xì)胞遷移中的作用是有爭(zhēng)議的，在不同的研究中，PAI-1顯示了抑制和促進(jìn)細(xì)胞遷移兩種似乎矛盾的作用。PAI-1阻止ECM降解，抑制uPAR依賴的或整合素依賴的細(xì)胞黏附，阻斷尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)誘導(dǎo)的趨化。通過(guò)這些作用，PAI-1抑制細(xì)胞遷移。PAI-1通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分離，調(diào)節(jié)趨化物質(zhì)，及其本身具有的趨化作用來(lái)促

3、進(jìn)細(xì)胞遷移。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，PAI-1還能夠調(diào)節(jié)某些細(xì)胞因子的水平。已證實(shí)PAI-1可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分布來(lái)影響細(xì)胞因子的水平，它能否直接影響細(xì)胞因子的表達(dá)有待進(jìn)一步研究。前期研究顯示，PAI-1在COPD患者的誘導(dǎo)痰中表達(dá)明顯升高，且和肺功能重要指標(biāo)FEV1％負(fù)相關(guān)，與重要炎癥因子IL-8水平正相關(guān)。這提示PAI-1在COPD的炎癥過(guò)程中扮演著重要角色，因此我們進(jìn)行本研究來(lái)明確PAI-1在COPD炎癥中的作用。
　　 方法：

4、1.培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞(A549細(xì)胞株)。2.根據(jù)Carp H.等的方法制備CSE。使用不同濃度的CSE和LPS刺激肺泡上皮細(xì)胞，ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中PAI-1表達(dá)情況，找出PAI-1表達(dá)高的最佳刺激濃度進(jìn)行下續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.用RT-PCR檢測(cè)CSE或LPS刺激肺泡上皮細(xì)胞后PAI-1mRNA表達(dá)的變化，用western blotting及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)PAI-1蛋白表達(dá)。肺泡上皮細(xì)胞上清中的PAI-1及炎癥因子IL-8,LTB4的表

5、達(dá)使用ELISA檢測(cè)。分離人靜脈血中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，進(jìn)行checkerboard實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)CSE和LPS刺激的肺泡上皮細(xì)胞趨化炎癥細(xì)胞的情況。4.分別使用特異的針對(duì)PAI-1的3對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染肺泡上皮細(xì)胞，RT-PCR檢驗(yàn)干擾效率，選擇出干擾效率最高的一對(duì)siRNA。5.PAI-1干擾實(shí)驗(yàn)分為以下6組：ncRNA空白組，ncRNA+CSE刺激組，ncRNA+LPS刺激組，siRNA空白組，siRNA+C

6、SE刺激組， siRNA+LPS刺激組。使用轉(zhuǎn)染效率最高的PAI-1特異的siRNA或陰性對(duì)照ncRNA轉(zhuǎn)染肺泡上皮細(xì)胞后，CSE或LPS刺激，使用RT-PCR，western blotting，ELISA，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)PAI-1的表達(dá)，ELISA檢測(cè)IL-8,LTB4的表達(dá)。Transwell小室法檢測(cè)特異性干擾肺泡上皮細(xì)胞PAI-1表達(dá)后炎癥細(xì)胞向其趨化的情況。6.用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組之間比較采用成組設(shè)計(jì)

7、資料兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：1.ELISA結(jié)果顯示暴露于10％CSE與75μg/mlLPS48小時(shí)后，PAI-1表達(dá)顯著升高，且與其他濃度的CSE或LPS刺激產(chǎn)生的PAI-1有顯著差異。2.RT-PCR結(jié)果顯示，暴露于10％CSE或75μg/ml LPS的肺泡上皮細(xì)胞PAI-1mRNA表達(dá)明顯增加；western blotting顯示，暴露于10％CSE或75μg/ml LPS的肺泡上皮細(xì)胞PAI-1蛋白表達(dá)明顯增加；

8、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，肺泡上皮細(xì)胞在受到10％CSE或75μg/ml LPS刺激后，細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組基本一致，而PAI-1呈顯著增強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)； ELISA結(jié)果顯示細(xì)胞上清中PAI-1表達(dá)與對(duì)照組相比也顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，IL-8表達(dá)顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)，LTB4表達(dá)顯著增加表達(dá)(P均＜0.01)。Transwell趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化明顯加強(qiáng)，10％CSE刺激后分別是對(duì)照組的

9、2.8±0.1倍(P＜0.01)及2.45±0.12倍(P＜0.01)，75μg/ml LPS刺激后分別是對(duì)照組的2.25±0.1l倍(P＜0.01)及2.9±0.15倍(P＜0.01)。3.RT-PCR結(jié)果顯示，第三對(duì)PAI-1特異的siRNA具有最佳的干擾效率，PAI-1mRNA表達(dá)水平顯著降低。4.免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ncRNA和siRNA的肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)基本一致，ncRNA+CSE刺激組和ncRNA+LPS刺激組可見(jiàn)肺泡

10、上皮細(xì)胞與ncRNA空白組相比有增強(qiáng)的陽(yáng)性表達(dá)，而siRNA空白組，siRNA+CSE刺激組和siRNA+LPS刺激組未見(jiàn)明顯的陽(yáng)性表達(dá)。RT-PCR和western blotting結(jié)果顯示，通過(guò)使用PAI-1特異的siRNA，肺泡上皮細(xì)胞的PAI-1mRNA及蛋白表達(dá)都明顯抑制，在受到CSE和LPS刺激后，也未見(jiàn)明顯增加。ELISA結(jié)果顯示，上清中IL-8表達(dá)siRNA空白組明顯少于ncRNA空白組(P＜0.01)，siRNA+CS

11、E刺激組IL-8表達(dá)與ncRNA+CSE刺激組相比較，明顯減少(P＜0.05)。siRNA+CSE刺激組上清中LTB4表達(dá)顯著低于ncRNA+CSE刺激組(P＜0.01)，siRNA+LPS刺激組上清中LTB4表達(dá)顯著低于ncRNA+LPS刺激組(P＜0.01)。單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化在特異性干擾PAI-1表達(dá)后明顯減弱。單核細(xì)胞趨化siRAN+CSE刺激組與ncRNA+CSE刺激組相比，siRAN+LPS刺激組與ncRNA+LPS

12、刺激組相比，均明顯減弱(P均＜0.01)。中性粒細(xì)胞趨化siRAN+CSE刺激組與ncRNA+CSE刺激組相比，siRAN+LPS刺激組與ncRNA+LPS刺激組相比，也同樣顯著減弱(P均＜0.01)。
　　 結(jié)論：1.通過(guò)暴露于CSE和LPS，肺泡上皮細(xì)胞PAI-1、炎癥因子(IL-8與LTB4)表達(dá)被明顯誘導(dǎo)，炎癥細(xì)胞(單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)被趨化。2.PAI-1是調(diào)節(jié)CSE和LPS刺激的肺泡上皮細(xì)胞IL-8和LTB4表達(dá)的