肺腺癌的放射生物學(xué)特性及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、目的：(1)觀察人肺腺癌細(xì)胞株A549與人肺腺癌耐DDP細(xì)胞株A549/DDP的放射生物學(xué)特性，探討肺腺癌耐DDP細(xì)胞株的耐藥性對(duì)其放射敏感性的影響。(2)建立A549與A549/DDP兩組細(xì)胞株的雙向凝膠電泳圖譜，識(shí)別并鑒定其差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，篩選肺腺癌耐藥、耐輻射相關(guān)蛋白質(zhì)。
　　 方法：(1)使用6MV-X射線對(duì)A549和549/DDP進(jìn)行照射，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)擬合細(xì)胞存活曲線，根據(jù)D0、Dq、N及SF2值等放射生物學(xué)參數(shù)

2、，比較2株腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞周期，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡率，分析2株腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布、凋亡率與放射敏感性之間的關(guān)系。(2)收集A549與A549/DDP總蛋白質(zhì)，應(yīng)用二維凝膠電泳(2-DE)分離2組總蛋白質(zhì)，采用PDquest7.1軟件進(jìn)行匹配和差異分析，識(shí)別兩組之間表達(dá)差異蛋白點(diǎn)。從膠中切取差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)原位酶解、酶解產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，獲取肽質(zhì)量指紋圖，數(shù)據(jù)庫搜索鑒定蛋白質(zhì)。使

3、用Western免疫印跡對(duì)其中3個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，免疫組化技術(shù)對(duì)上述3個(gè)差異蛋白質(zhì)在肺腺癌的化療耐藥組及化療敏感組的差異表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：(1)2株腫瘤細(xì)胞D0、Dq、N及SF2值大小為A549A549/DDP。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到6Gy照射后2組細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，且A549較A549/DDP阻滯明顯，照射后24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)A549及A549/DDP2組細(xì)胞有

4、顯著性差異(p<0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)到明顯的凋亡峰、腫瘤細(xì)胞凋亡率，并且2種腫瘤細(xì)胞株凋亡峰值依次為A549>A549/DDP，與其放射敏感性高低一致。(2)成功地進(jìn)行了肺腺癌細(xì)胞株A549與A549/DDP蛋白質(zhì)的分離，建立了分辨率較高、重復(fù)性較好的A549與A549/DDP細(xì)胞蛋白質(zhì)的2-DE圖譜，識(shí)別了45個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，鑒定了27個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)按功能主要可以分為六類：①基本代謝相關(guān)的酶類：如ATP sy

5、nthase subunit beta,mitochondrial、Egl nine homolog1、Delta(3，5)-Delta(2，4)-dienoyl-COA isomerase，mitochondrial、Triosephosphate isomerase、Proteasome subunit alphatype-6、Cytochrome b5 type B、Fatty acid-binding protein，epide

6、rmal、Hemoglobin subunit beta等；②信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白：如Cofilin—1、Keratin，typeⅠ cytoskeletal18、Keratin，typeⅢ cytoskeletal1等；③與解毒和轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白：如Peroxiredoxin-4、Elongation factor1-delta、Membrane—associated progesterone receptor component2、Pu

7、tative
　　 RNA—binding protein3、Probable ATP-dependent RNA helicase DDX6等；④分子伴侶：如Heat shock protein beta-1、10 KDa heat shock protein，mitochondrial等；⑤細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)：如Vimentin、Tubulin betachain、Tubulin beta-2A chain、PDZ and

8、LIM domain protein1、Myosinregulatory light chain MRLC2、Histidine triad nucleotide—binding protein1、Histone H2B type1-C/E/F/G/I等；⑥鈣結(jié)合蛋白：Annexin A2、Annexin A4。Western免疫印跡分析證實(shí)了差異蛋白質(zhì)：Heat shockprotein beta-1、Annexin A4、Vimen