蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)肝母細(xì)胞瘤生物學(xué)協(xié)同網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的研究.pdf

1、目的:
　　肝母細(xì)胞瘤是一種常見(jiàn)的多能干細(xì)胞分化的肝臟腫瘤，研究顯示:肝母細(xì)胞瘤患者的生存率都隨著其分期的升高而下降。目前常用的診斷、判斷預(yù)后的血清標(biāo)志物是甲胎蛋白，但在多種疾病及正常新生兒、小嬰兒中均升高，特異性較低。由此可見(jiàn)，利用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)尋找一種高特異性、高敏感性的肝母細(xì)胞瘤早期檢測(cè)方法迫在眉睫。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤中的研究可以用于疾病早期診斷、療效監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷等方面。目前，已有成功檢測(cè)出腎母細(xì)胞瘤、卵巢癌、乳

2、腺癌等癌癥的生物學(xué)標(biāo)記物。本研究組前期應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)腎母細(xì)胞瘤血清、瘤體組織進(jìn)行了深入的研究，研究得出的生物學(xué)標(biāo)記物目前已進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，試驗(yàn)結(jié)果初步表明蛋白質(zhì)組學(xué)可篩選、鑒定出可靠的高特異性、高敏感性標(biāo)記物;本實(shí)驗(yàn)室前期蛋白質(zhì)組學(xué)已初篩出肝母細(xì)胞瘤的血清生物標(biāo)記物，本研究進(jìn)一步細(xì)化分組，深入研究，驗(yàn)證前期試驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)該標(biāo)記物在不同分期、不同手術(shù)方式、不同診療階段患者的血清學(xué)生物表達(dá)，進(jìn)一步研究該標(biāo)記物與肝母細(xì)胞瘤的關(guān)系及對(duì)腫瘤的

3、影響。
　　材料與方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)材料
　　本課題選取肝母細(xì)胞瘤患者血清樣本294例份，健康對(duì)照組血清80例份。分為術(shù)前組（根據(jù)pre-text分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期17，Ⅲ期38例、Ⅳ期15例）、術(shù)后組、化療組、治愈組、復(fù)發(fā)組。取材條件:晨起、空腹、外周靜脈血5ml，4℃下靜置1h，3000r/min離心15min，取上清液。所有病理結(jié)果均經(jīng)過(guò)兩次病理學(xué)檢驗(yàn)無(wú)誤。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　2.1.肝母細(xì)

4、胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的篩選及其表達(dá)強(qiáng)度對(duì)比
　　血清在冰（水）浴上緩慢融解，離心，加樣、混勻血清樣本與U9處理液;混勻期間將蛋白質(zhì)芯片裝入96孔蛋白質(zhì)芯片工作支架Bio-processor中，記錄芯片編號(hào);每孔中加入NaAC（100mmol/L，pH=4）200μl，置入曾析柜振蕩平衡（600rpm，室溫，5min），去除液體，重復(fù)操作平衡一次。取樣本100μl，U9處理，加入芯片，置于層析柜1h，快速拍干，加入Binding B

5、uffer200μl振蕩（600rpm，室溫，5min），甩去殘液，快速拍干，重復(fù)操作2次。清洗、甩干、置于Bio-processor中，干燥后加入1μl的SPA溶液(50％)，重復(fù)一次此操作，待自然干燥即可在SELDI-TOF-MAS平臺(tái)上檢測(cè)。
　　設(shè)置SELDI-TOF-MS參數(shù)，將結(jié)合好待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)芯片裝入SELDI-TOF-MS中進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)血清差異性蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選。采用CiphergenBiosystems軟件3.

6、1版本原始數(shù)據(jù)進(jìn)行校正，采用ZUCIPDAS網(wǎng)絡(luò)服務(wù)軟件分析蛋白質(zhì)芯片數(shù)據(jù)，得到樣本中各個(gè)m/z及其對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)峰值，將m/z差異小于0.3％的歸為同一類(lèi)。
　　質(zhì)譜數(shù)據(jù)過(guò)濾噪音，聚類(lèi)分析，使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析。再經(jīng)過(guò)SVM篩選出youden指數(shù)最高的組合模型，得出肝母細(xì)胞瘤特異性血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物，同時(shí)對(duì)不同組別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)比該標(biāo)記物在肝母細(xì)胞瘤不同分期、不同手術(shù)方式、不同診療階段患兒血清中的表達(dá)差異。
　　2

7、.2.肝母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的純化與鑒定
　　取目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量較高的血清樣本作為分離純化對(duì)象。取100μl血清樣品，將血清樣本用ACN沉淀大分子蛋白質(zhì)，用C18反相高壓液相色譜柱對(duì)經(jīng)上述處理后的血清樣品進(jìn)行分離純化，用EP管收集對(duì)應(yīng)于HPLC圖上峰值中的蛋白質(zhì)，真空濃縮至20μl，使用MALDI-TOF-MS檢測(cè)，找出目標(biāo)蛋白質(zhì)所在的樣本。
　　在純化后的目標(biāo)蛋白質(zhì)內(nèi)，依次加入尿素、DTT、NH4HCO3、胰酶等，37

8、℃酶解過(guò)夜，終止酶解反應(yīng)，離心取上清，加入到C18蛋白質(zhì)樣品檢測(cè)的梯度洗脫柱，與2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)串聯(lián)，檢測(cè)肽段質(zhì)荷比圖譜，使用SEQUEST程序檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)Bioworks數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到相匹配的蛋白質(zhì)。
　　2.3.肝母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物的驗(yàn)證及動(dòng)態(tài)對(duì)比
　　采用ELISA方法對(duì)每組隨機(jī)抽樣進(jìn)行檢測(cè)。取標(biāo)準(zhǔn)品、樣品各100μl分別加入預(yù)包被抗人Apo A-Ⅰ抗體的96孔板中;稀釋?zhuān)跤窗?，依次加入作?/p>

9、液體，直至加終止液終止顯色反應(yīng)。讀出各孔吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。
　　結(jié)果:
　　1.肝母細(xì)胞瘤血清蛋白標(biāo)記物的篩選
　　本試驗(yàn)結(jié)果得出m/z峰為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段為肝母細(xì)胞瘤血清蛋白質(zhì)標(biāo)記物。
　　2.目標(biāo)蛋白標(biāo)記物在肝母細(xì)胞瘤不同治療階段患兒血清中的表達(dá)對(duì)比
　　對(duì)對(duì)照組、術(shù)前組、術(shù)后組、化療組、治愈組、復(fù)發(fā)組中的m/z9348Da蛋白質(zhì)標(biāo)記物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，該標(biāo)記物在術(shù)前組、術(shù)后組、復(fù)

10、發(fā)組中呈現(xiàn)低表達(dá);在對(duì)照組、化療組、治愈組中高表達(dá);表達(dá)強(qiáng)度分別為3893.21±593.03、1713.31±316.55、2213.85±247.15、2996.72±541.58、3610.36±310.07、913.37±230.72，上述各組兩兩對(duì)比，除術(shù)前組、術(shù)后組、復(fù)發(fā)組差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.目標(biāo)蛋白質(zhì)標(biāo)記物在不同分期肝母細(xì)胞瘤患兒血清中的表達(dá)對(duì)比
　　對(duì)各組進(jìn)行上述方法篩選

11、并統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出質(zhì)荷比為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段在各組中的表達(dá)差異。術(shù)前pre-text分期篩選得出Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期表達(dá)強(qiáng)度分別為2524.12±679.42、1718.90±418.62、1268.11±399.09、635.91±237.56，Ⅰ期、Ⅱ期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0386＞0.01)，其余任意相鄰兩組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。
　　4.肝母細(xì)胞瘤血清標(biāo)記物的純化及鑒定
　　將蛋白質(zhì)

12、經(jīng)高效液相色譜分析純化、收集，找出質(zhì)荷比為9348Da的樣品，將質(zhì)荷比為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段進(jìn)行酶解并通過(guò)2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)檢測(cè)，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得出其為Apo A-Ⅰ的一個(gè)肽段。
　　5.不同分期肝母細(xì)胞瘤術(shù)前血清中蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量的對(duì)比
　　取肝母細(xì)胞瘤不同分期血清樣本各10個(gè)，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)各組ApoA-Ⅰ蛋白質(zhì)的濃度，結(jié)果示Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期依次為154.14±34.45μg/mL，130.5

13、1±31.37μg/mL，86.32±14.44μg/mL，32.87±16.44μg/mL，相對(duì)于正常對(duì)照組均為低表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度依次降低，且各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6.不同治療階段血清中蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量的對(duì)比
　　取正常對(duì)照組、術(shù)前組、術(shù)后組、化療組、治愈組、復(fù)發(fā)組的血清樣品各10個(gè)，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)各組Apo A-Ⅰ蛋白質(zhì)的濃度，結(jié)果示各組蛋白質(zhì)濃度分別為正常對(duì)照組為235.34±14.42μg/mL;術(shù)前組為8

14、1.26±17.18μg/mL;術(shù)后組110.52±17.47μg/mL，化療組229.02±7.65μg/mL;治愈組222.14±20.23μg/mL，復(fù)發(fā)組90.63±13.58μg/mL。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示:治愈組與正常組血清中Apo A-Ⅰ蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.01)，其余各組與正常組中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01);復(fù)發(fā)組與術(shù)前組血清中Apo A-Ⅰ蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.01)，其余各組與術(shù)前組中均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(

15、p＜0.01);術(shù)后組、化療組中Apo A-Ⅰ蛋白表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。
　　7.不同手術(shù)方式患兒不同階段血清中蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量的對(duì)比
　　取試驗(yàn)中Ⅲ、Ⅳ期患兒根據(jù)不同的手術(shù)方式分為血管結(jié)扎組及血管修補(bǔ)組，應(yīng)用ELISA法對(duì)兩組不同階段血清組Apo A-Ⅰ蛋白質(zhì)的濃度做出檢測(cè)，結(jié)果顯示:兩組術(shù)前差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;術(shù)后及化療后濃度均有升高，血管修補(bǔ)組較結(jié)扎組升高較多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩組治愈后的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

16、，但臨床資料顯示，結(jié)扎組總治愈率較修補(bǔ)組稍低。
　　8.不同預(yù)后患兒血清中蛋白質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)量的對(duì)比
　　取預(yù)后不良組、預(yù)后良好組血清各10份，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)各組Apo A-Ⅰ蛋白質(zhì)的濃度，結(jié)果顯示:分別為預(yù)后不良組:39.17±16.92μg/mL，預(yù)后良好組:97.38±41.83μg/mL;二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段為肝母細(xì)胞

17、瘤特異性血清標(biāo)記物。
　　2.質(zhì)荷比為9348Da的蛋白質(zhì)或肽段經(jīng)過(guò)鑒定其為Apo A-Ⅰ，它在肝母細(xì)胞瘤患兒血清中的表達(dá)與健康兒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可作為HB血清生物學(xué)標(biāo)記物應(yīng)用于臨床，對(duì)構(gòu)建肝母細(xì)胞瘤診療的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建有臨床意義。
　　3.Apo A-Ⅰ的含量在肝母細(xì)胞瘤患兒與正常兒血清中存在的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在肝母細(xì)胞瘤不同期別患兒中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同手術(shù)方式、治療不同時(shí)期的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同預(yù)后的患兒術(shù)前該蛋白質(zhì)