P53介導鼻咽癌細胞放射生物學效應的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、背景與目的：鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma，NPC)是我國南方地區(qū)的一種常見惡性腫瘤，NPC的主要治療手段為放射治療，但總的效果仍不夠理想，NPC放療后5年生存率仍然徘徊在40-50％。p53基因是一種重要的抑瘤基因，參與DNA損傷后修復，調(diào)控DNA損傷所觸發(fā)的細胞周期運行及細胞凋亡，介導腫瘤的放射生物學效應，因此，p53與腫瘤的放射敏感性密切相關。功能失活的p53基因則不具備這些功能，導致腫瘤對放射敏感性降低

2、，甚至使腫瘤產(chǎn)生放射抗拒。研究表明，60％以上的NPC組織和幾乎100％的NPC細胞株有p53蛋白過表達，而且NPC中過表達的p53蛋白的功能可能異?；蚴Щ?。但至今NPC中過表達的p53蛋白對NPC的放療敏感性有無影響仍然不清楚，p53蛋白介導NPC放射應答的機制仍然需要進一步闡明。因此，觀察過表達的p53蛋白對NPC放射敏感性的影響，尋找與p53介導放療敏感性相關的蛋白質(zhì)，將有助于闡明p53參與NPC放射應答的機制。 方法：(

3、1)p53沉默對人鼻咽癌細胞株CNE2放射生物學特性的影響：以穩(wěn)定沉默p53基因表達的NPC細胞株CNE2sip53和對照細胞株CNE2/pSUPER為對象，采用集落存活分析法檢測在不同放射劑量照射后的細胞存活分數(shù)(SF)并計算放射生物學參數(shù)D0，α，β和放射敏感比(SER)；采用MTT法檢測放射線對細胞生長的影響；采用流式細胞術(shù)和Hochest33342染色檢測放射線對細胞周期及凋亡的影響；(2)蛋白質(zhì)組學技術(shù)尋找與p53介導CNE2

4、細胞放療敏感性相關的蛋白質(zhì)：采用雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)分離CNE2sip53以及CNE2/pSUPER細胞放射前后的蛋白質(zhì)，PDQuest圖像分析軟件識別CNE2sip53以及CNE2/pSUPER細胞放射前后的差異蛋白質(zhì)點，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)鑒定差異蛋白質(zhì)；Western blot驗證差異蛋白質(zhì)HSP70、Tcp-1β、Annexin A2和14-3-3σ在CNE2sip53以及CNE2

5、/pSUPER細胞放射前后的表達水平。 結(jié)果：(1)CNE2sip53細胞照射后的SF值高于CNE2/pSUPER細胞的SF；與CNE2/pSUPER細胞相比，CNE2sip53細胞照射后D0值和SF2值均增大，而α值，β值和SER均減??；(2)放射線誘導CNE2sip53細胞凋亡及對細胞增殖的抑制作用弱于其對CNE2/pSUPER細胞的作用；(3)放射線誘導CNE2/pSUPER細胞阻滯于G1期，而誘導CNE2sip53細胞阻

6、滯于G2期；(4)建立了CNE2/pSUPER以及CNE2sip53細胞放射前后的二維凝膠電泳圖譜，質(zhì)譜分析鑒定了CNE2/pSUPER細胞放射前后的19個差異蛋白質(zhì)以及CNE2sip53細胞放射前后的15個差異蛋白質(zhì)，Western blot驗證了14-3.3σ、HSP70、Tcp-1B和Annexin A2在兩種細胞放射前后的差異表達水平；(5)對CNE2/pSUPER以及CNE2sip53細胞放射前后的差異蛋白質(zhì)的異同進行比較分析

7、，識別了14個不同的差異蛋白質(zhì)，既Pyrophosphatase 1、Annexin A1、14-3-3 protein sigma、Proteasome(prosome，macropain)subunit、Prohibitin、Peroxiredoxin-2、Glutathionetransferase，GRg78 precursor，Cytokeratin 18，Ras-related protein，Glutathione tra

8、nsferase omega 1-1、NM23-H1、Calmodulin-relatedprotein和Electron transfer flavoprotein subunit alpha；生物信息學分析顯示，其中7個蛋白質(zhì)即Annexin A1、14-3-3 protein sigma、Proteasomesubunit、Prohibitin、Glutathione transferase、GRP78 precursor和Cyt

9、okeratin 18與p53存在直接或間接的相互作用關系。 結(jié)論：(1)NPC細胞中過表達的p53蛋白具有生物學功能，參與放射誘導的NPC細胞損傷和凋亡過程；(2)采用2-DE技術(shù)建立了CNE2sip53以及CNE2/pSUPER細胞放射前后的二維凝膠電泳圖譜，質(zhì)譜分析鑒定了19個CNE2/pSUPER細胞放射前后的差異表達蛋白質(zhì)以及15個CNE2sip53細胞放射前后的差異表達蛋白質(zhì)，為研究NPC放射生物學提供了有價值的資料