內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與細(xì)胞脂肪變性的研究.pdf

1、目的：
　　 隨著生活水平的提高，生活方式的日益西化，非酒精性脂肪性肝?。∟onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率日益升高。NAFLD包括一系列相互聯(lián)系的病理改變，從單純性脂肪肝、脂肪性肝炎，到肝纖維化和肝硬化，甚至可以進(jìn)展為肝細(xì)胞癌。NAFLD已經(jīng)成為影響我們健康的潛在的重大疾病隱患。并且愈來愈多的資料表明，NAFLD是心腦血管事件和肥胖相關(guān)死亡事件的獨(dú)立相關(guān)的疾病。目前認(rèn)為，NA

2、FLD與肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征密切相關(guān)，高脂飲食是引起肥胖及其相關(guān)并存癥高發(fā)的重要原因。而高脂飲食往往合并有血漿游離脂肪酸的升高，游離脂肪酸可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞的單純脂肪變性，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚未明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激已被證實(shí)參與多種疾病的分子機(jī)制，包括肥胖和2型糖尿病，后兩者都是NAFLD的高危因素。明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與了游離脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞脂肪變性模型的脂變形成過程，并探討藥物比如二甲雙胍對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的潛在影響，對(duì)于防治NAFL

3、D具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 方法：
　　 1.培養(yǎng)和處理細(xì)胞
　　 常規(guī)10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到約70-80％融合度時(shí)，消化傳代，更換培養(yǎng)液進(jìn)行分組。對(duì)照組換用10ml新鮮的10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液；二甲雙胍組換用lOml新鮮的10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液的同時(shí)加入0.4ml的50mM二甲雙胍的母液（即終濃度為2mM）；游離脂肪酸組換用10ml含有l(wèi)mM游離脂肪酸混合物（2:1油酸

4、：棕櫚酸）的10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液；干預(yù)組換用10ml含有l(wèi)mM游離脂肪酸混合物的10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液的同時(shí)加入0.4ml的50mM二甲雙胍的母液（即終濃度為2mM）。培養(yǎng)24小時(shí)后收獲各組細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活力和脂質(zhì)含量及后續(xù)的PCR和WESTERN BLOT。
　　 2.逆轉(zhuǎn)錄PCR
　　 分別提取各組HepG2細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄盒提供的說明書合成cDNA.設(shè)計(jì)及合成葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)和固

5、醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白lc(SREBPlc)以及脂肪酸合成酶（FAS)的引物，以cDNA作模板，在常規(guī)PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，用PDQuesat半定量分析比較各個(gè)PCR產(chǎn)物條帶灰度，以目的基因/β-actin mRNA相對(duì)值半定量目的基因，分析比較以上表達(dá)水平的差異。
　　 3.Western blot
　　 分別裂解細(xì)胞后，用BCA法定量蛋白，檢測(cè)各組葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78

6、）和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白lc(SREBPlc)表達(dá)水平，顯色、暴光、顯影、定影后，吹干，將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的凈光密度值，以目的蛋白/GAPDH相對(duì)值半定量目的蛋白，分析比較以上表達(dá)水平的差異。
　　 結(jié)果：
　　 游離脂肪酸組誘導(dǎo)的細(xì)胞脂肪變性模型的HepG2細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯，GRP78的mRNA和蛋白表達(dá)水平，SREBPIc的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以及FAS mRNA分別表達(dá)水平是298.0

7、0±59.63 mmol/mg protein，1.67±0.20，2.21±0.20，0.89±0.22，1.44±0.14，1.00±0.10，與對(duì)照組、二甲雙胍組比較，均明顯升高，有顯著性差異(p<0.05).而干預(yù)組的HepG2細(xì)胞的甘油三酯、GRP78的mRNA和蛋白表達(dá)水平，SREBPlc的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以及FAS mRNA表達(dá)水平分別是270.33±91.82mmol/mg protein，1.50±15，1.2