內質網(wǎng)應激參與細胞脂肪變性的研究.pdf

1、目的：
　　 隨著生活水平的提高，生活方式的日益西化，非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率日益升高。NAFLD包括一系列相互聯(lián)系的病理改變，從單純性脂肪肝、脂肪性肝炎，到肝纖維化和肝硬化，甚至可以進展為肝細胞癌。NAFLD已經成為影響我們健康的潛在的重大疾病隱患。并且愈來愈多的資料表明，NAFLD是心腦血管事件和肥胖相關死亡事件的獨立相關的疾病。目前認為，NA

2、FLD與肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征密切相關，高脂飲食是引起肥胖及其相關并存癥高發(fā)的重要原因。而高脂飲食往往合并有血漿游離脂肪酸的升高，游離脂肪酸可以誘導肝細胞的單純脂肪變性，但其確切的發(fā)病機制尚未明確。內質網(wǎng)應激已被證實參與多種疾病的分子機制，包括肥胖和2型糖尿病，后兩者都是NAFLD的高危因素。明確內質網(wǎng)應激是否參與了游離脂肪酸誘導的細胞脂肪變性模型的脂變形成過程，并探討藥物比如二甲雙胍對內質網(wǎng)應激的潛在影響，對于防治NAFL

3、D具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 方法：
　　 1.培養(yǎng)和處理細胞
　　 常規(guī)10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2，當細胞生長到約70-80％融合度時，消化傳代，更換培養(yǎng)液進行分組。對照組換用10ml新鮮的10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液；二甲雙胍組換用lOml新鮮的10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液的同時加入0.4ml的50mM二甲雙胍的母液（即終濃度為2mM）；游離脂肪酸組換用10ml含有l(wèi)mM游離脂肪酸混合物（2:1油酸

4、：棕櫚酸）的10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液；干預組換用10ml含有l(wèi)mM游離脂肪酸混合物的10％胎牛血清MEM培養(yǎng)液的同時加入0.4ml的50mM二甲雙胍的母液（即終濃度為2mM）。培養(yǎng)24小時后收獲各組細胞，檢測細胞活力和脂質含量及后續(xù)的PCR和WESTERN BLOT。
　　 2.逆轉錄PCR
　　 分別提取各組HepG2細胞的總RNA，按照反轉錄盒提供的說明書合成cDNA.設計及合成葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)和固

5、醇調節(jié)元件結合蛋白lc(SREBPlc)以及脂肪酸合成酶（FAS)的引物，以cDNA作模板，在常規(guī)PCR儀上進行PCR擴增。PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳分析，用PDQuesat半定量分析比較各個PCR產物條帶灰度，以目的基因/β-actin mRNA相對值半定量目的基因，分析比較以上表達水平的差異。
　　 3.Western blot
　　 分別裂解細胞后，用BCA法定量蛋白，檢測各組葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78

6、）和固醇調節(jié)元件結合蛋白lc(SREBPlc)表達水平，顯色、暴光、顯影、定影后，吹干，將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的凈光密度值，以目的蛋白/GAPDH相對值半定量目的蛋白，分析比較以上表達水平的差異。
　　 結果：
　　 游離脂肪酸組誘導的細胞脂肪變性模型的HepG2細胞內的甘油三酯，GRP78的mRNA和蛋白表達水平，SREBPIc的mRNA和蛋白表達水平，以及FAS mRNA分別表達水平是298.0

7、0±59.63 mmol/mg protein，1.67±0.20，2.21±0.20，0.89±0.22，1.44±0.14，1.00±0.10，與對照組、二甲雙胍組比較，均明顯升高，有顯著性差異(p<0.05).而干預組的HepG2細胞的甘油三酯、GRP78的mRNA和蛋白表達水平，SREBPlc的mRNA和蛋白表達水平，以及FAS mRNA表達水平分別是270.33±91.82mmol/mg protein，1.50±15，1.2