活性氧介導的胎盤內質網應激參與鎘致畸作用.pdf

1、目的:孕期母體鎘暴露引起胎兒畸形和生長發(fā)育遲緩,而眾多研究提示母體鎘不能透過胎盤屏障。本研究主要探討胎盤損傷在鎘致畸中作用,并初步研究胎盤氧化應激和內質網應激可能在鎘引起胎盤損傷中的作用。方法:本研究主要由4個實驗組成。實驗一:建立鎘引起小鼠畸形模型。孕鼠被隨機分為2組,鎘處理組小鼠于受孕第9天經腹腔單次給予氯化鎘(CdCl2,4.5 mg/kg),對照組孕鼠給予等容積生理鹽水。于受孕第18天剖殺所有孕鼠,剖宮取胎鼠,記錄活胎數(shù)、死胎數(shù)

2、和吸收胎數(shù),測量胎鼠身長,稱活胎和胎盤重量,并評價胎鼠外觀畸形。實驗二:評價胎盤病理損傷。孕鼠被隨機分為2組,鎘處理組小鼠于受孕第9天經腹腔單次給予CdCl2(4.5 mg/kg),對照組孕鼠給予等容積生理鹽水。先于孕第10天剖殺半數(shù)孕鼠,收集胎盤進行增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組織化學染色;接著于小鼠受孕第18天剖殺剩余孕鼠,收集胎盤進行常規(guī)HE染色檢查和細胞凋亡檢測。實驗三:檢測胎盤內質網應激和氧化應激。孕鼠被隨機分為2組,鎘處理

3、組小鼠于受孕第9天經腹腔單次給予CdCl2(4.5 mg/kg),對照組孕鼠給予等容積生理鹽水。為探討鎘誘導的小鼠胎盤內質網應激的時間-效應關系,鎘處理后不同時點(2 h、8 h和24 h)剖殺對照組和鎘處理組孕鼠,收集胎盤,用實時定量RT-PCR技術檢測胎盤內質網應激相關基因[葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)、葡萄糖調節(jié)蛋白94(GRP94)激活轉錄因子4(ATF4)、內質網甘露糖苷酶-Ⅰ樣蛋白(EDEM)]的含量;用免疫印跡法檢測胎

4、盤內質網應激相關蛋白[GRP78、磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2α)、C/EBP同源蛋白(CHOP)]的表達水平。此外,本實驗還進行了胎盤還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測定,并用實時定量RT-PCR技術檢測胎盤氧化應激相關基因HO-1和iNOS的含量;用免疫印跡法檢測胎盤氧化應激相關蛋白[三硝化酪氨酸(3-NT)、血紅素加氧酶(HO-1)]的表達水平。實驗四:觀察活性氧是否介導胎盤內質網應激。孕鼠被隨機分成4組,鎘處理組小鼠于受孕

5、第9天經腹腔單次給予CdCl2(4.5 mg/kg),單純PBN組小鼠于受孕第9天經腹腔間隔4 h分兩次給予2-苯叔丁基硝酮(PBN,100 mg/kg),PBN干預組小鼠經腹腔給予CdCl2(4.5 mg/kg)處理前30 min和處理后4 h分別給予PBN(100 mg/kg,ip)。對照組孕鼠于受孕第9天給予等容積生理鹽水,于鎘處理8h后剖殺所有孕鼠,收集胎盤,并用實時定量RT-PCR技術檢測胎盤內質網應激CHOP和基因胎盤氧化應

6、激HO-1基因的含量;用免疫印跡法檢測胎盤氧化應激(3-NT、HO-1)和內質網應激(GRP78、CHOP和peIF2α)的相關蛋白表達水平;用免疫組織化學染色法對胎盤3-NT及HO-1蛋白進行定位。結果:孕期母體鎘暴露明顯升高窩胎鼠指(趾)部和尾部畸形率,顯著降低胎鼠身長、活胎重和胎盤重。胎盤組織HE染色結果顯示,胎盤迷路層的平均血竇區(qū)域明顯減少;免疫組織化學結果表明,鎘處理組小鼠胎盤迷路層PCNA陽性增殖細胞數(shù)較對照組明顯減少;TU

7、NEL結果發(fā)現(xiàn),鎘處理小鼠胎盤迷路層TUNEL陽性細胞數(shù)較對照組顯著増多。孕期母體鎘處理8 h后,小鼠胎盤組織GRP78和ATF4 mRNA水平明顯升高,且胎盤組織GRP78、peIF2α和CHOP蛋白表達顯著上調,這提示孕期鎘暴露明顯誘導小鼠胎盤內質網應激。此外,孕期母體鎘暴露明顯降低胎盤組織中還原型GSH含量,顯著上調胎盤HO-1和3-NT蛋白表達,這提示孕期鎘暴露明顯誘導小鼠胎盤氧化應激。進一步研究結果發(fā)現(xiàn),自由基清除劑PBN處理