脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)系膜細胞凋亡的分子機制.pdf

1、目的:糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）作為糖尿病最常見的的并發(fā)癥，其發(fā)病率和致死率逐漸增加，并成為導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。腎小球的病理改變首先是基底膜增厚、系膜細胞增生、細胞外基質(zhì)增加，隨之系膜細胞凋亡、腎小球階段性硬化、腎小球濾過率下降，最終導(dǎo)致腎功能衰竭。系膜細胞的凋亡及細胞外基質(zhì)的增加在DN的進程中起著重要作用。高血糖及其代謝產(chǎn)物最初被認為是加重糖尿病腎病進程的主要因素。但隨著研究的深入，脂質(zhì)在非脂肪

2、細胞中異位聚集并影響細胞功能導(dǎo)致細胞凋亡即所謂的“脂毒性”進入人們的視野。但其導(dǎo)致細胞凋亡的分子機制尚不完全清楚。脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白（ adipocyte fatty acid binding protein，F(xiàn)ABP4，ap2），是脂肪酸結(jié)合蛋白家族中最具特征性的成員，參與游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）和其他親脂性物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，在調(diào)節(jié)炎癥、胰島素抵抗、代謝性疾病中起著重要作用。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplas

3、mic reticulum，ER）是脂質(zhì)合成、Ca2+儲存和蛋白質(zhì)折疊與成熟的重要場所。它參與內(nèi)源性細胞凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)一旦被打亂，就會導(dǎo)致非折疊蛋白的聚集以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ endoplasmic reticulum strss，ERS）或未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），持續(xù)的 ERS最終導(dǎo)致細胞凋亡。已知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是感受與脂質(zhì)代謝相關(guān)應(yīng)激的重要靶細胞器，高濃度FFAs通過ERS可以引起包

4、括胰島β細胞和肝細胞在內(nèi)的多種細胞凋亡，即“脂性凋亡”，但分子機制尚不清楚。
　　我們的前期試驗已首次證實人腎小球系膜細胞正常時可表達FABP4，高糖和高FFAs可誘導(dǎo)其FABP4表達上調(diào)、發(fā)生ERS，細胞凋亡增加。由此推測FABP4參與FFAs誘導(dǎo)ERS及ERS相關(guān)凋亡通路。據(jù)此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，在細胞學(xué)水平擬通過抑制FABP4表達，觀察高糖和高FFAs誘導(dǎo)的ERS及ERS相關(guān)凋亡通路的變化，探討FABP4的作用。實驗

5、分為兩部分：1 RNA干擾技術(shù)敲低人腎系膜細胞（Human Mesangial Cell，HMC）的FABP4，比較敲低前后高糖和FFA誘導(dǎo)的ERS及 ERS相關(guān)凋亡指標在蛋白和 mRNA水平的表達變化，探究 FABP4、FFA、ERS在細胞凋亡中的作用；2 PPAR-γ激動劑吡格列酮干預(yù)HMC，在蛋白和mRNA水平比較干預(yù)前后高糖和FFA誘導(dǎo)FABP4、ERS及ERS相關(guān)凋亡指標表達變化，進一步明確FABP4、 FFA、ERS在細胞凋

6、亡中的上下游關(guān)系。
　　方法：
　　1、RNA干擾技術(shù)敲低HMC的FABP4，比較敲低前后高糖和FFA誘導(dǎo)的ERS及ERS相關(guān)凋亡指標在蛋白和mRNA水平的表達變化
　?。?）實驗分組：HMC細胞隨機分為高糖（HG）、高油酸（OA）、高棕櫚酸（PA）三種刺激組。每種刺激組均對應(yīng)正常對照組（Control， Ctrl）、空質(zhì)粒組（nontargeting control，NCsi）、質(zhì)粒敲低組（FABP4 siRNA，

7、FABP4si）、刺激加質(zhì)粒敲低組（Stimuli+FABP4 siRNA）、刺激組（Stimuli）五組。
　?。?）應(yīng)用Western Blot以及Real-Time PCR觀察HG、OA和PA刺激對HMC FABP4蛋白和mRNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達變化。
　?。?）用RNA干擾技術(shù)敲低FABP4，觀察敲低前后三種刺激對HMC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA

8、的表達變化。
　　2、PPAR-γ激動劑吡格列酮干預(yù)HMC，在蛋白和mRNA水平比較干預(yù)前后高糖和FFA誘導(dǎo)FABP4、ERS及ERS相關(guān)凋亡指標表達變化
　　（1）實驗分組：HMC細胞隨機分為高糖（HG）、高油酸（OA）、高棕櫚酸（PA）三種刺激組。每種刺激組均對應(yīng)正常對照組（Control， Ctrl）、0.5％DMSO組、刺激加吡格列酮干預(yù)組（Stimuli+ Pi）、刺激組（Stimuli）四組。
　?。?）應(yīng)

9、用Western Blot以及Real-Time PCR檢測HG、OA和PA刺激對HMC FABP4蛋白和mRNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達變化。
　?。?）用吡格列酮進行干預(yù)，觀察干預(yù)前后三種刺激對HMC的FABP4蛋白和mRNA、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達變化。
　　結(jié)果：1第一部分（1）HG、OA和PA刺激對HMC FABP4蛋白和mRNA表達的影響：三

10、種刺激明顯上調(diào)HMC FABP4蛋白和mRNA的表達；（2）HG、OA和PA刺激對ERS和ERS相關(guān)凋亡指標的影響：三種刺激在蛋白水平顯著上調(diào)GRP78、p-IRE1a、p-PERK、ATF6和CHOP、Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase12的表達，在 mRNA水平明顯上調(diào)GRP78、IRE1a、PERK、ATF6和 CHOP；（3）RNA干擾技術(shù)對 HMC中FABP4表達量的影響：FABP4si組FABP

11、4蛋白表達量顯著低于Control組；（4）用RNA干擾技術(shù)敲低FABP4，觀察敲低前后三種刺激對HMC的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白和mRNA、凋亡相關(guān)蛋白和mRNA的表達變化：與單純刺激組相比，F(xiàn)ABP4敲低后HG、OA和PA刺激導(dǎo)致的GRP78、p-IRE1a、p-PERK、ATF6 ERS相關(guān)蛋白以及CHOP、Cleaved Caspase3、Caspase12凋亡相關(guān)蛋白蛋白表達量以及 HG、OA和 PA刺激導(dǎo)致的GRP78、IRE1a

12、、PERK、ATF6 ERS相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白CHOP的mRNA水平顯著下降；（5）空質(zhì)粒對HMC FABP4、ERS和ERS相關(guān)凋亡指標的影響：空質(zhì)粒組 HMC FABP4、ERS和ERS相關(guān)凋亡相關(guān)蛋白和mRNA表達量與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。2第二部分（1）用吡格列酮進行干預(yù)，觀察干預(yù)前后HG、OA和PA刺激對HMC的FABP4蛋白和mRNA表達的影響：吡格列酮明顯下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的HMC FABP4蛋白和mRNA

13、的表達,但吡格列酮干預(yù)前后PA刺激組FABP4表達量均高于正常對照組；（2）觀察吡格列酮干預(yù)前后HG、OA和PA刺激對 HMC的 ERS相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響：吡格列酮顯著下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的HMC ERS相關(guān)蛋白GRP78、p-IRE1a、p-PERK、ATF6的表達，同時也明顯下調(diào) HG和 OA刺激誘導(dǎo)的 CHOP、Cleaved Caspase3細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達；但吡格列酮干預(yù)不能下調(diào)PA刺激組GRP78、p-

14、IRE1a、p-PERK、ATF6和CHOP、Cleaved Caspase3的高表達；（3）觀察吡格列酮干預(yù)前后HG、OA和PA刺激對HMC的ERS相關(guān)基因和凋亡相關(guān)基因表達的影響：吡格列酮明顯下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的HMC ERS相關(guān)基因GRP78、IRE1a、PERK、ATF6的表達，同時明顯下調(diào)HG和OA刺激誘導(dǎo)的CHOP細胞凋亡相關(guān)基因的表達；但吡格列酮干預(yù)不能下調(diào)PA刺激的GRP78、IRE1a、PERK、ATF6和CHOP

15、 mRNA的高表達。
　　結(jié)論：
　　1、HG、OA和 PA可以在蛋白和 mRNA水平上調(diào)人系膜細胞中的FABP4和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡指標水平。證明FFA和高糖可以誘導(dǎo)FABP4表達，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)凋亡途徑。
　　2、抑制FABP4表達可以在蛋白和mRNA水平下調(diào)HG、OA和PA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標及凋亡相關(guān)指標的高表達。證明FABP4介導(dǎo)高糖和FFA誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，F(xiàn)ABP4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)