重組大腸桿菌生產(chǎn)類人膠原蛋白Ⅲ發(fā)酵條件優(yōu)化與分離純化研究.pdf

1、為了提高類人膠原蛋白Ⅲ(human—likecollagenⅢ，簡稱HLCⅢ)產(chǎn)量，本研究主要從培養(yǎng)基、發(fā)酵過程參數(shù)、補(bǔ)料方式和分離純化等方面出發(fā)對重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)HLCⅢ進(jìn)行了優(yōu)化。 培養(yǎng)基優(yōu)化，采用搖瓶培養(yǎng)的方式利用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。首先通過單因素實(shí)驗(yàn)從葡萄糖、甘油和蔗糖中篩選出葡萄糖甘油質(zhì)量比為1：4的混合碳源，從硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和硝酸鈉中篩選出硫酸銨與酵母粉共同作為培養(yǎng)基的氮源。再采用Plackett—Burm

2、an設(shè)計(jì)從混合碳源、硫酸銨、酵母粉、硫酸鎂、EDTA、磷酸鹽、氯化鈣和微量元素中篩選出對HLCⅢ產(chǎn)量影響顯著的三個(gè)因素即混合碳源、硫酸銨和酵母粉。然后，采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最佳值區(qū)域，以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中建立有效的響應(yīng)面方程。通過響應(yīng)面法的Box—Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，得到高度模擬實(shí)際實(shí)驗(yàn)的回歸方程，并由此獲得了三個(gè)顯著影響因素的最佳取值(混合碳源12.24g/L，硫酸銨7.12g/L，酵母粉5.53g/)，所對應(yīng)的HLCⅢ產(chǎn)量的預(yù)測最高值

3、為6.05g/L。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示在發(fā)酵罐中利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基可使HLCⅢ產(chǎn)量達(dá)到6.12g/L，較優(yōu)化前提高了將近三倍。 對于發(fā)酵過程參數(shù)優(yōu)化同樣采用響應(yīng)面法，采用12.8L發(fā)酵罐培養(yǎng)的方式進(jìn)行試驗(yàn)。首先采用Plackett—Burman設(shè)計(jì)從接種量、誘導(dǎo)時(shí)間、接種齡、裝液量、罐壓、空氣流量、pH和溶氧8個(gè)發(fā)酵參數(shù)中篩選出對HLCⅢ產(chǎn)量影響顯著的三個(gè)因素，即誘導(dǎo)時(shí)間、接種齡和pH。然后采用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)法逼近最佳值區(qū)域，利用響應(yīng)

4、面法求出這三個(gè)因素的最佳取值(誘導(dǎo)時(shí)間3.3h，接種齡13h和pH7.0)，并獲得最高HLCⅢ產(chǎn)量(9.87g/L)。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，采用優(yōu)化后的發(fā)酵過程參數(shù)能夠使HLCⅢ產(chǎn)量達(dá)到9.68/L，較優(yōu)化前提高了約60％。 在補(bǔ)料控制策略方面，實(shí)驗(yàn)中考察了不同補(bǔ)糖方式(連續(xù)流加補(bǔ)糖和間歇補(bǔ)糖)、不同補(bǔ)氮方式(連續(xù)流加補(bǔ)氮和間歇補(bǔ)氮)、不同比生長速率(0.05～0.1h-1，0.1～0.15h-1，0.15～0.2h-1，0.2～0.2