重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)多聚體質(zhì)粒DNA的研究.pdf

1、質(zhì)粒DNA作為生物藥劑(尤其作為基因治療和基因疫苗的載體)的意義和需求越來越大。質(zhì)粒DNA作為一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體，優(yōu)點是安全可靠、穩(wěn)定、對外源基因的容納量大、不會引起免疫系統(tǒng)反應(yīng)及易于生產(chǎn)等。多聚體的一個質(zhì)粒中含有多個目的基因的拷貝，能夠提高轉(zhuǎn)染效率和目的基因的表達(dá)量，因而受到了特別的關(guān)注。但國內(nèi)外對于多聚體質(zhì)粒的研究較少，隨著基因治療和DNA疫苗對質(zhì)粒的需求越來越大，開發(fā)一個重復(fù)性高、易于放大的多聚體質(zhì)粒的生產(chǎn)工藝有著重要的意義

2、。 本文對利用重組大腸桿菌(E. coli DH5α)發(fā)酵生產(chǎn)二聚體質(zhì)粒pUC21-dimer和四聚體質(zhì)粒pUC21-tetramer的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝進(jìn)行系統(tǒng)的研究。首先采用搖瓶實驗找出適合菌體生長和質(zhì)粒復(fù)制的培養(yǎng)基組分，接著考察部分培養(yǎng)條件對對菌體生長的影響，然后考察了質(zhì)粒的穩(wěn)定性，最后在優(yōu)化后培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對發(fā)酵罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)的葡萄糖流加策略進(jìn)行了研究。 搖瓶培養(yǎng)實驗優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為：葡萄糖5.0 g L-

3、1，酵母汁10.0 gL-1，NaCl10.0 g L-1，K2HPO48.0 g L-1，KH2PO44.0 g L-1，檸檬酸1.7 g L-1，MgSO4·7H2O1.2 g L-1，微量元素溶液1.0 mL L-1。發(fā)酵條件的考察表明，菌種需要經(jīng)過高濃度氨芐平板的篩選，才能獲得高拷貝數(shù)的重組菌，并且經(jīng)測質(zhì)粒穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)接20次的重組菌仍然保持高的穩(wěn)定性。該質(zhì)粒是溫度不敏感型，不適宜用升溫策略。 發(fā)酵罐培養(yǎng)實驗結(jié)果表明，對數(shù)

4、期流加比穩(wěn)定期流加能更好地滿足菌體的生長，達(dá)到的最高生物量和質(zhì)粒產(chǎn)量也較高。對幾種流加方式的考察發(fā)現(xiàn)，DO反饋流加方式，操作簡單，反饋靈敏，準(zhǔn)確度高，獲得的生物量和質(zhì)粒產(chǎn)量均較其他發(fā)酵方式高，達(dá)到的最高生物量為30.84 g L-1，質(zhì)粒pUC21-dimer的最大產(chǎn)量為96.38 mg L-1；采用該流加策略發(fā)酵生產(chǎn)四聚體質(zhì)粒，達(dá)到的最高生物量為16.44 gL-1，質(zhì)粒pUC21-tetramer的最大產(chǎn)量為112.06 mg L-