早期應(yīng)用甲基強(qiáng)的松龍上調(diào)大鼠受損脊髓神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)HSP27蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓作為中樞神經(jīng)的一部分，不但是支配肢體運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、內(nèi)臟活動(dòng)的低級(jí)中樞，而且是聯(lián)系高級(jí)神經(jīng)中樞(大腦)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，上、下行神經(jīng)傳導(dǎo)束密集，即使局部的損傷也會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的后果，損傷平面以下的機(jī)體部分與大腦的聯(lián)系中斷，可導(dǎo)致永久性的偏癱或四肢癱及其癱瘓部位感覺(jué)功能喪失，或伴有疼痛、運(yùn)動(dòng)和自主反射加強(qiáng)等癥狀。近年來(lái)，隨著交通和建筑業(yè)的發(fā)展，脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)的發(fā)生率每年都在上升。脊髓損傷后神經(jīng)

2、功能的保護(hù)和恢復(fù)對(duì)于醫(yī)學(xué)界仍然是世界性的一大難題。脊髓損傷分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，脊髓的原發(fā)性損傷是指受傷時(shí)由于骨折的移位、脫位引起椎間盤脫入椎管及骨折片刺入脊髓而造成的脊髓壓迫、沖擊、撕裂、挫裂及剪切傷，是在受傷的一瞬間由外力產(chǎn)生的不可逆的損傷，目前尚無(wú)法針對(duì)其進(jìn)行有效的治療。繼發(fā)性損傷是脊髓的原發(fā)性損傷之后由于各種因素引起的脊髓再損傷，所產(chǎn)生的脊髓損害有時(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了原發(fā)性損傷。為了改善脊髓損傷后的結(jié)果，大量的各種各樣的實(shí)驗(yàn)主要都

3、是針對(duì)繼發(fā)性損傷進(jìn)行的。 神經(jīng)細(xì)胞在遭受應(yīng)激性刺激后會(huì)迅速產(chǎn)生所謂的應(yīng)激蛋白或熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)。從其他的的實(shí)驗(yàn)研究中我們已經(jīng)知道其中一些HSPs，如熱休克蛋白27(HSP27)能夠通過(guò)各種機(jī)制，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。一個(gè)亞致死性的刺激如熱休克、暫時(shí)性缺血能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生HSP27，幫助細(xì)胞更好地抵抗嚴(yán)重的損傷性刺激。但由于這種刺激不能控制HSPs表達(dá)區(qū)域、表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)類型，臨

4、床大部分脊髓損傷都為突發(fā)性，這種方法無(wú)法應(yīng)用于臨床?；蚣夹g(shù)己經(jīng)能夠使有機(jī)體在特定的組織和細(xì)胞中大量表達(dá)HSP27，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)細(xì)胞，但目前還僅限于體外培養(yǎng)的細(xì)胞和部分動(dòng)物體內(nèi)，要應(yīng)用于脊髓損傷病人，仍需較長(zhǎng)時(shí)間。目前，如果能夠通過(guò)藥物誘導(dǎo)HSP27在脊髓內(nèi)大量地表達(dá)，對(duì)臨床治療脊髓損傷則具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。臨床上一些嚴(yán)重脊髓壓迫的病人，由于脊髓缺血一再灌注損傷，在手術(shù)解除脊髓壓迫后，病人可能發(fā)生癱瘓：脊柱畸形矯正手術(shù)很可能導(dǎo)

5、致脊髓牽拉傷。這些情況如果能夠通過(guò)手術(shù)中、手術(shù)后使用藥物誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)細(xì)胞大量表達(dá)HSP27，則對(duì)術(shù)中、術(shù)后脊髓神經(jīng)功能的維護(hù)和恢復(fù)具有積極的意義。甲基強(qiáng)的松龍(Methylprednisolone，MP)是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的唯一一個(gè)用于治療急性脊髓損傷的藥物。其標(biāo)準(zhǔn)治療方案己經(jīng)在世界各地廣泛應(yīng)用。研究表明MP，通過(guò)多方面機(jī)理發(fā)揮其對(duì)脊髓的保護(hù)作用，但是否存在這樣一個(gè)機(jī)理--MP通過(guò)誘導(dǎo)HSP27表達(dá)而在某種程度上發(fā)揮它對(duì)脊髓神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)

6、作用?目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。 本課題通過(guò)制作急性脊髓損傷動(dòng)物模型，然后8小時(shí)內(nèi)治療性應(yīng)用大劑量甲基強(qiáng)的松龍，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)脊髓組織細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)，來(lái)探討甲基強(qiáng)的松龍是否通過(guò)誘導(dǎo)脊髓組織細(xì)胞內(nèi)HSP27的表達(dá)而在某種程度起到神經(jīng)保護(hù)作用及其可能的作用機(jī)制。 材料與方法： 1.動(dòng)物模型制作和分組SD雌性大鼠50只，質(zhì)量240±20g。隨機(jī)分成三組：對(duì)照組單純手術(shù)組(OP組)10只，僅行椎板切除術(shù)，5min后

7、按體重計(jì)算從尾靜脈注入生理鹽水(量與相應(yīng)MP治療組量同)；模型組(SCI組)20只，行椎板切除后重物打擊，5min后按體重計(jì)算從尾靜脈注入生理鹽水(量與相應(yīng)MP治療組量同)；實(shí)驗(yàn)組20只(MP組)，行椎板切除后重物打擊，5min后按體重計(jì)算從尾靜脈注入甲基強(qiáng)的松龍30mg/kg。采用Allen重物打擊法，脊髓損傷后24h標(biāo)本取材。 2.病理標(biāo)本取材實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后用4﹪多聚甲醛全身灌注，后取損傷脊髓遠(yuǎn)端0.5cm處脊髓，長(zhǎng)1.0c

8、m，常規(guī)甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。 3.免疫組織化學(xué)染色和圖像分析切片免疫組織化學(xué)染色。采用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性染色物質(zhì)吸光度：每張片隨機(jī)選取6個(gè)不同視野，400高倍鏡下用計(jì)算機(jī)計(jì)算出平均吸光度值A(chǔ)，A反應(yīng)染色強(qiáng)度，代表相對(duì)含量。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，按α=0．01檢驗(yàn)水準(zhǔn)，三樣本均數(shù)量?jī)蓛砷g行雙側(cè)t檢驗(yàn)。 結(jié)果：

9、 1．大鼠脊髓損傷后，損傷段脊髓有明顯出血、水腫、變性、空泡、壞死等病理變化，打擊兩端的繼發(fā)性損傷嚴(yán)重。 2．單純手術(shù)組脊髓內(nèi)HSP27的表達(dá)呈弱陽(yáng)性，單純損傷組脊髓神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)HSP27表達(dá)明顯增加。 3．早期大劑量使用MP后，脊髓的繼發(fā)性損傷減輕：HSP27的表達(dá)明顯增強(qiáng)，顯示為強(qiáng)陽(yáng)性。 4．HSP27的表達(dá)水平上，MP組與SCI組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P<0．01)；SCI組與OP組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著