肝細(xì)胞癌中SEMA 3B蛋白的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、目的:SEMA3B是一種分泌性蛋白，蛋白有前體和分泌型兩種，分子量分別為83kd、51kd，基因位于3p21.3的LUCA區(qū)，在肝細(xì)胞癌中存在很高的甲基化(～83％)它的主要作用除了對(duì)神經(jīng)細(xì)胞軸突發(fā)育發(fā)揮作用外，還能誘導(dǎo)乳腺癌、肺癌的凋亡。新近研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)，SEMA3B在前列腺癌、卵巢癌等多種腫瘤中有不同程度的表達(dá)下調(diào)，最近有研究表明SEMA3B基因在肝細(xì)胞癌中存在較高的失活率，但在蛋白水平的表達(dá)及其臨床意義尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)S

2、EMA3B蛋白在肝細(xì)胞癌中表達(dá)情況，分析其與肝細(xì)胞癌患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，探討SEMA3B能否作為評(píng)價(jià)患者預(yù)后的重要指標(biāo)。
　　 資料與方法:1.臨床標(biāo)本與病理資料收集56例2008年7月至2009年6月山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌患者癌組織和癌旁組織（癌旁組織距癌切線≥1cm），同時(shí)收集14例正常肝組織作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查，手術(shù)切緣均未查見(jiàn)轉(zhuǎn)移。所有肝癌患者術(shù)前均未行射頻消融、介入等特殊治療，其中男47例，

3、女9例。年齡32-73歲，中位年齡56歲。所有標(biāo)本離體后立即取材，一部分放置于液氮中保存，另一部分放于中性福爾馬林后進(jìn)行石臘包埋切片。
　　 2.免疫組織化學(xué)SEMA3B多克隆抗體（ABCAM，英國(guó)）1(∶)200稀釋。步驟按照通用二抗試劑盒（GeneTex，美國(guó)）說(shuō)明書進(jìn)行。鼠抗人CD34單克隆抗體（SANTA，美國(guó)）1(∶)200稀釋。實(shí)驗(yàn)步驟同SEMA3B。WesternBlotting證實(shí)高表達(dá)SEMA3B的肝癌標(biāo)本為陽(yáng)

4、性對(duì)照，CD34以正常肝組織血管作為陽(yáng)性對(duì)照;PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。SEMA3B以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)。采用半定量積分法，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野，高倍鏡下計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞(1)染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色0分，黃色1分，棕黃色2分.黃褐色3分;(2)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25％者0分，～50％者1分，～75％者2分，＞75％者3分;(3)按上述兩者評(píng)分之和為:0～3分為(-)，4分及以上為(+)。MVD計(jì)數(shù)方

5、法:在100×光鏡下觀察下，選取5個(gè)血管密度最高的區(qū)域，然后在200×光鏡（0.708mm2）下計(jì)數(shù)。5個(gè)區(qū)域的平均值作為MVD值。將每個(gè)染成棕色的細(xì)胞和細(xì)胞簇、有或無(wú)完整管腔結(jié)構(gòu)定義為一個(gè)血管。結(jié)果判斷均由2名高年資病理科醫(yī)生核準(zhǔn)。
　　 3.Westernblotting用研磨棒將200mg組織研碎，加入0.6ml細(xì)胞裂解液（北京碧云天公司）30min，然后在12000rpm4℃離心10min，取上清液。根據(jù)BCA蛋白濃度定

6、量試劑盒（北京碧云天公司）測(cè)量蛋白濃度。蛋白100℃變性5min。取50μg總蛋白，以10％聚丙酰胺凝膠電泳后，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，TBST配置5％脫脂奶粉封閉1小時(shí)。將PVDF膜置入∶5000稀釋的兔抗人SEMA3B多克隆抗體(ABCAM，英國(guó))中，4℃孵育過(guò)夜。第二天TBST洗膜10min*3次后放入1∶2000稀釋的羊抗兔二抗（北京碧云天公司）室溫1.5小時(shí)。用TBST洗膜10min*3次。ECL發(fā)光試劑盒（MILLI

7、PORE，美國(guó)）進(jìn)行顯影曝光。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的組間比較采用x2檢驗(yàn)，采用Kaplan—Meier生存分析方法繪制生存曲線，生存曲線差異比較采用LogRank法，使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果:1.SEMA3B蛋白的表達(dá)情況:SEMA3B定位于肝癌癌細(xì)胞、癌旁細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的胞漿。免疫組化檢測(cè)了56例肝細(xì)胞癌、癌旁肝組織及14例正常肝組織中SEMA3B

8、蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示:肝細(xì)胞癌組織SEMA3B的陽(yáng)性率為42.9％，低于正常肝組織及癌旁組織（陽(yáng)性率分別為78.6％、85.7％），P值均小于0.05，差異顯著。Westernblotting顯示肝癌組織的表達(dá)量低于癌旁肝組織，得到與免疫組化相同的結(jié)果。
　　 2.MVD的表達(dá):在本實(shí)驗(yàn)中，200×光鏡視野下(0.708mm2)所得到的MVD的中位數(shù)值為92，將MVD值＞92定義為高表達(dá)，≤92的為低表達(dá)。其中高表達(dá)組為112±

9、7.5，低表達(dá)組為85.1±4.4。SEMA3B陰性組中的MVD值明顯高于陽(yáng)性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SEMA3B與MVD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　 3.SEMA3B蛋白與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系:根據(jù)肝細(xì)胞癌的臨床病理特征（性別、年齡、乙肝、AFP、肝硬化程度、腫瘤細(xì)胞分化情況、大小、有無(wú)完整包膜、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、CLIP評(píng)分以及TNM分期進(jìn)行分組，研究SEMA3B蛋白在HCC中表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系。SEMA3B陽(yáng)性組的

10、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)多于陰性組，陽(yáng)性組的腫瘤大于陰性組，陽(yáng)性組的腫瘤包膜完整數(shù)多于陰性組，陽(yáng)性組的CLIP評(píng)分低于陰性組，P值分別為0.045、0.034、0.009、0.013，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.SEMA3B蛋白與預(yù)后的關(guān)系:本組56例肝癌患者均獲隨訪，其中SEMA3B蛋白陽(yáng)性組24例，陰性組32例。陽(yáng)性組的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率明顯低于陰性組(P=0.009，圖6);陽(yáng)性組的生存率顯著高于陰性組。
　　 結(jié)論:SEMA3B蛋