rAAV介導調(diào)控VEGF基因表達對缺血性腦損傷大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生影響的研究.pdf

1、實驗目的： 1.分別構(gòu)建、制備攜帶外源性hVEGF165基因和靶向內(nèi)源性VEGF基因短發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)雙鏈RNA(ShortHairpinRNA，shRNA)片段的2型重組腺相關(guān)病毒載體(RecombinantAdeno-associatedViralVector，rAAV)，為后續(xù)研究提供實驗工具。 2.觀察缺血性腦損傷后海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖的時空規(guī)律，以及齒狀回新生細胞的遷移和功能特點。 3.探討缺血性腦損傷

2、后海馬內(nèi)源性VEGF表達的時間和空間分布特點. 4.探討在海馬導入外源性hVEGF165基因?qū)θ毖阅X損傷后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響 實驗方法： 第一部分：攜帶hVEGF165基因和靶向內(nèi)源性VEGF基因shRNA的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建和制備 1.通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建攜帶hVEGF165基因的2型rAAV(rAAV2)包裝質(zhì)粒pSNAV2.0-hVEGF165-IRES-EGFP，并進行酶切鑒定；

3、 2.根據(jù)鼠源VEGF基因(NM031836)CDS區(qū)編碼序列設計、選擇三段19nt的寡核苷酸序列作為靶向內(nèi)源性VEGF基因的shRNA片段序列，并以此合成三對長引物單鏈DNA片段，經(jīng)退火、雙酶切后與同樣雙酶切的質(zhì)粒pDC316-EGFP-U6連接、轉(zhuǎn)化，獲得三個質(zhì)粒； 3.將獲得的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK細胞，以RealTimePCR和Westernblot方法篩選 4.通過一種輔助病毒感染一個載體細胞株的策略，分別制備

4、rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)病毒載體。 第二部分：腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖、分化及新生細胞功能的研究 1.采用不同劑量BrdU經(jīng)腹腔注射入大鼠體內(nèi)，應用免疫組織化學方法確定BrdlJ標記大鼠海馬齒狀回新生細胞的最佳BrdU給藥劑量； 2.利用4-VO(FourVesselOcclusion)法建立大鼠全腦缺血再灌注損傷模型，于缺

5、血性腦損傷后不同時間點經(jīng)腹腔注射BrdU. 3.利用免疫組織化學和雙標記、三標記免疫組織熒光化學方法觀察缺血性腦損傷后齒狀回新生細胞遷移、分化及功能特點。 第三部分：內(nèi)源性VEGF基因在腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生中的作用及機制研究 1.首先采用RealTimePCR方法和免疫組織化學、免疫組織熒光化學方法對缺血性腦損傷后海馬內(nèi)源性VEGFmRNA、齒狀回VEGF蛋白表達的時空特點以及齒狀回微血管密度(Micr

6、ovesselDensity，MVD)的變化進行觀察； 2.將rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)立體定向微量注射給藥至大鼠右側(cè)海馬齒狀回，觀察其對缺血性腦損傷后不同時間點海馬內(nèi)源性VEGFmRNA水平、齒狀回VEGF蛋白表達、齒狀回微血管密度、齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖水平及齒狀回新生細胞遷移的影響。 第四部分：重組腺相關(guān)病毒載體介導外源性VEGF基因表達對腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響 1.將

7、攜帶hVEGF165基因的rAAV2載體立體定向微量注射給藥至大鼠右側(cè)海馬齒狀回，2w后建立大鼠腦缺血模型，采用RealTimePCR方法觀察其對缺血性腦損傷后不同時間點右側(cè)海馬hVEGF165mRNA水平的影響； 2.采用免疫組織化學和免疫組織熒光化學方法觀察比較海馬齒狀回外源性hVEGFl65基因長期表達對缺血性腦損傷后不同時間點齒狀回VEGF蛋白表達、齒狀回MVD及齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響。 實驗結(jié)果： 第一部

8、分：攜帶hVEGF165基因和靶向內(nèi)源性VEGF基因shRNA的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建和制備 1.鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建的病毒包裝質(zhì)粒pSNAV2.0-hVEGF165-IRES-EGFP構(gòu)建正確。 2.鑒定結(jié)果顯示構(gòu)建的3個攜帶靶向鼠內(nèi)源性VEGF基因shRNA片段的質(zhì)粒構(gòu)建正確，均攜帶有啟動EGFP轉(zhuǎn)錄的CMV啟動子和啟動shRNA序列轉(zhuǎn)錄的U6啟動子。 3.制備的兩株病毒載體rAAV2-hVEGF165-IRE

9、S-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)經(jīng)鑒定和質(zhì)量檢測，結(jié)果顯示構(gòu)建、包裝準確，純度好，感染細胞效率高。 第二部分：腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖、分化及新生細胞功能的研究 1.BrdU腹腔給藥劑量為10mg/kg組大鼠齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)與50mg/kg、100mg/kg劑量組均有顯著性差異 2.大鼠腦缺血后3d時，齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)量較對照組增多(P<0.05)，并

10、于缺血后第6d時達到高峰(P<0.01)，缺血后第48d時恢復至正常水平(P>0.05)。 3.缺血性腦損傷大鼠齒狀回新生細胞(BrdU陽性細胞)存活4w后大多呈單個散在分布狀態(tài). 第三部分：內(nèi)源性VEGF基因在腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生中的作用及機制研究 1.缺血性腦損傷后海馬VEGFmRNA表達水平反應性升高，缺血后24hr達到峰值，與正常對照組和其它各時間點大鼠相比差異均有顯著性意義(P<0.05)；其

11、后海馬VEGFmRNA水平開始逐漸下降，于缺血后第12d回落至正常水平(P>0.05)。 2.免疫組織化學染色結(jié)果顯示缺血性腦損傷后可見VEGF蛋白少量表達，24hr海馬VEGF蛋白強陽性表達，12d時僅有弱表達；缺血性腦損傷后VEGF蛋白在海馬區(qū)的表達主要集中于海馬齒狀回。 3.免疫組織化學染色結(jié)果顯示正常對照組大鼠海馬區(qū)僅有CD34抗原(MVD指標)呈條索狀弱陽性表達 4.rAAV2-EGFP-U6-shRN

12、A(VEGF)立體定向微量注射給藥至大鼠右側(cè)海馬齒狀回，2w后制作缺血性腦損傷動物模型。 5.RealTimePCR分析結(jié)果 6.免疫組織化學染色結(jié)果 7.免疫組織化學染色結(jié)果 第四部分：重組腺相關(guān)病毒載體介導外源性VEGF基因表達對腦缺血后大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響 1.RealTimePCR檢測結(jié)果；免疫組織化學染色結(jié)果。 2.免疫組織化學染色結(jié)果 3.導入外源性hVEGF1

13、65基因大鼠缺血性腦損傷后6d和24hr時，其右側(cè)海馬齒狀回BrdU陽性細胞數(shù)均顯著高于同時間點缺血性腦損傷大鼠(P<0.05)。 結(jié)論： 1.本課題中制備的兩株病毒載體rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)，構(gòu)建、包裝準確，純度好，感染細胞效率高。 2.采用立體定向技術(shù)將制備的兩株病毒載體微量注射給藥至海馬齒狀回后可以在該區(qū)域高效、穩(wěn)定和持續(xù)的表達外

14、源性hVEGF165或剔降內(nèi)源性VEGF基因表達。 3.2型rAAV是一種合適的中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因?qū)胼d體，利用病毒載體實現(xiàn)RNAi是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)進行功能基因鑒定的有效研究手段。 4.50mg/kg以上劑量的BrdU腹腔注射給藥可較為理想的標記海馬齒狀回新生細胞。 5.缺血性腦損傷可誘導海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞增殖水平在一定時間窗(3d～24d)內(nèi)上調(diào)。 6.缺血性腦損傷后海馬齒狀回新生細胞可遷移入顆粒細胞

15、層，并具備原有功能性顆粒細胞同樣的形態(tài)學特點，合成并表達神經(jīng)活性遞質(zhì)。 7.缺血性腦損傷后遷移入顆粒細胞層的海馬齒狀回新生細胞可與其周圍的顆粒細胞一樣，在病理性刺激下同時被迅速激活。 8.缺血性腦損傷后，海馬內(nèi)源性VEGF基因表達水平反應性上調(diào)促進缺血誘導的齒狀回神經(jīng)發(fā)生和齒狀回新生血管形成。 9.不同細胞來源的VEGF在缺血性腦損傷后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生過程中發(fā)揮了不同的作用。 10.缺血性腦損傷后與內(nèi)源

16、性VEGF基因表達水平變化相關(guān)的新生血管形成主要參與了缺血性腦損傷后齒狀回新生細胞的分化和遷移過程，并在其中發(fā)揮對新生細胞的支持、營養(yǎng)和遷移導向作用。 11.缺血性腦損傷后，不同細胞來源的。 12.海馬齒狀回導入外源性hVEGF165基因可促進缺血性腦損傷誘導的齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平上調(diào)。 本課題的主要創(chuàng)新點： 1.從分子和基因水平全面、系統(tǒng)的探討了海馬內(nèi)源性VEGF基因表達在缺血性腦損傷后海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生

17、中的作用及相關(guān)機制； 2.從基因治療的角度探討了導入外源性VEGF基因?qū)θ毖阅X損傷后涉及海馬結(jié)構(gòu)和功能重塑相關(guān)神經(jīng)生物學事件的影響及治療意義，為以VEGF基因為靶點進行缺血性腦血管病基因治療研究和VEGF基因治療產(chǎn)品最終進入缺血性腦血管病臨床治療提供了不可或缺的實驗數(shù)據(jù)； 3.為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)利用病毒基因載體通過RNA干擾(RNAinterference，RNAi)封閉內(nèi)源性基因表達和介導外源性基因轉(zhuǎn)移的技術(shù)手段進行功