拓展邊緣性供肝應(yīng)用的臨床和實驗研究.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分：拓展邊緣性供肝應(yīng)用的臨床研究 隨著移植外科技術(shù)的日臻完善、器官保存方法的不斷改進、新型免疫抑制劑的成功研制及移植免疫理論的不斷發(fā)展,器官移植已取得了巨大成就,成為挽救各類終末期臟器疾病的有效手段,創(chuàng)造了巨大的社會和經(jīng)濟效益,其成就已為醫(yī)學界和社會所肯定.迄今全球已有近80萬病人接受了器官移植術(shù).臨床肝臟移植(LT)經(jīng)過40年的發(fā)展,已成為終末期肝病的唯一有效治療方法.如何選擇合適的邊緣性肝臟作

2、為供體,使其規(guī)范化并采取適當措施減輕其損傷仍是器官移植醫(yī)師面臨的重要課題. 本研究主要著眼于供肝脂肪變性和冷缺血時問延長兩方面來探討邊緣性供肝在我國是否有其應(yīng)用價值. 對象和方法： 1、研究對象 2003年1月到2005年9月,我單位連續(xù)實施了204例成人(年齡大于16歲)尸肝肝移植. 2、研究方法 供肝的脂肪變性程度通過有經(jīng)驗的移植外科醫(yī)師在獲取和保存過程中的視診和觸診進行判斷.如初步判

3、斷脂肪變性程度較為嚴重則行冰凍切片檢查,快速評估供肝脂肪變性程度.如為重度脂肪變性,則摒棄不用.脂肪空泡占據(jù)了細胞質(zhì)大部分空間,細胞核被擠到邊緣認為是大泡性肝細胞脂肪變性.大泡性脂肪變性的分級:Ⅰ級,沒有脂肪變性;Ⅱ級,輕度脂肪變性(<30﹪);Ⅲ級,中度脂肪變性(30﹪-60﹪);Ⅳ級,重度脂肪變性(>60﹪). 研究變量為:供體年齡、性別、供肝重量、供肝重量與供肝受體重量比(GRBW)、冷缺血時間,受體年齡、性別、體重、原發(fā)

4、疾病、移植前肝功能(總膽紅素[TB],谷丙轉(zhuǎn)氨酶[ALT],谷草轉(zhuǎn)氨酶[AST],凝血酶原時間[PT])及腎功能(肌酐[Scr],尿素氮[BUN]),移植前終末期肝病的評分(MELD評分),移植后肝功能及腎功能.移植前的數(shù)據(jù)在移植術(shù)前24h內(nèi)收集,移植后的肝功能和腎功能在移植后一周內(nèi)每日觀測.所有病人均在門診常規(guī)隨訪.早期移植物功能不全(EAD)定義為術(shù)后2-7天內(nèi)至少出現(xiàn)以下一種情況:TB>10mg/dL,PT≥17s,肝性腦病.早期

5、腎功能不全(ERD)定義為術(shù)后一周內(nèi)出現(xiàn)SCr≥2md/dL和/或需要透析治療維持. 3、統(tǒng)計分析 所有實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,P<0.05判定有統(tǒng)計學差異. 結(jié)果： 供肝脂肪變性分布比例如下:非中重度脂肪變性組,(n=160;78.4﹪):中度脂肪變性組,(n=44;21.6﹪).肝移植術(shù)后1周內(nèi)肝腎功能動態(tài)變化兩組間變化趨勢一致,1-7d兩組問變量比較無明顯差異.ALT和AST

6、術(shù)后1d最高,5d內(nèi)呈明顯下降趨勢,5d后可基本恢復至正常水平;TB在術(shù)后1-2d達峰值,以后逐漸下降至較低水平; PT于3d后可基本恢復正常水平;SCr波動于0.8-1.2mg/dL,呈小幅度變化;而BUN相對維持在較高水平.PNF發(fā)生率為0﹪.EAD、ERD,病人累計生存率及移植物累計生存率在兩組問均無顯著差異(P>0.05).59例病人(28.9﹪)接受CIT延長供肝.肝移植術(shù)后1周內(nèi)肝腎功能動態(tài)變化在CIT延長組及CIT正常組間

7、變化趨勢相似,1-7d兩組問變量比較均無明顯差異.CIT延長組的EAD發(fā)生率明顯高于CⅡ、正常組(30.4﹪vs.18.3﹪,P<0.05).病人累積生存率及移植物累積存活率在CIT延長組均明顯差于CIT正常組(P均<0.05).中度脂肪變性合并CIT延長組的EAD發(fā)生率明顯高于非中重度脂肪變性合并CIT正常組,病人生存率及移植物存活率均低于非中重度脂肪變性合并CIT正常組(P<0.05). 結(jié)論： 1.中度脂肪變性供肝

8、并不影響肝移植病人術(shù)后早期肝腎功能的恢復,也不影響病人和移植物的存活率,可以安全的作為供肝系統(tǒng)的一部分. 2.CIT延長供肝早期移植物功能不良的發(fā)生率高,且病人的生存率及移植物的存活率均顯著下降. 3.中度脂肪變性供肝合并冷缺血時間延長時，對受體和移植物預后較差，應(yīng)當常規(guī)丟棄。 第二部分:邊緣性供肝移植的實驗研究 國外一些移植中心提出所謂邊緣性肝臟的概念,指一些處于邊緣應(yīng)用狀態(tài)的供體肝臟,如脂肪變性供肝、

9、酒精性肝病供肝、熱缺血或冷缺血時間延長供肝以及年齡大于50歲的老年供肝等.先前的臨床研究已經(jīng)得出了僅僅中度脂肪變性供肝并不影響移植物功能及病人生存率,而合并冷缺血時間延長供肝將顯著影響移植物及病人的結(jié)果.為了進一步在前瞻性研究中證實這一結(jié)果,并深入研究其發(fā)生機制,從而探索邊緣性移植物的保護性干預,減輕移植物損傷、提高聯(lián)合移植療效,我們開展了邊緣性供肝的實驗研究. 目前引起矚目的保護性基因A20編碼7鋅指結(jié)構(gòu)蛋白,具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)

10、和免疫應(yīng)答,發(fā)揮抗細胞凋亡和抗組織損傷的強大作用,其體外實驗觀察到,多種炎癥刺激因子或細胞因子如TNFα、IL-1、 脂多糖等都能誘導A20表達,其誘導依賴于核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活,同時又對NF-κB的激活起負反饋調(diào)節(jié)作用,阻斷NF-κB的活化,抑制NF-κB依賴性的iNOS等一系列前炎性基因的表達.我們利用基因組學研究通過比較觀察脂肪變性供肝、脂肪變性合并冷缺血時間延長供肝和正常供肝大鼠在移植后不同時點A20的表達,探討邊緣性供

11、肝對移植物功能及生存率的影響機制. 材料與方法: 1.動物模型 1.1大鼠脂肪變性模型的建立 健康成年雄性Lewis大鼠喂養(yǎng)膽堿.蛋氨酸缺乏飼料后6W后隨機挑選5只處死檢測,觀察脂肪變性程度,并檢測肝臟組織中GSH、MDA、MPO指標.1.2大鼠原位肝移植模型的建立 采用本單位改良的Kamada-Calne方法行大鼠原位肝移植.2.動物模型分組 采用雄性Lewis大鼠分別作為供體和受體,共

12、分成3組:脂肪變性供肝移植組(Steatotic donor liver group,S組),脂肪變性+冷缺血時間延長(6h)供肝移植組(Steatotic+prolonged cold ischemia time donor liver group,SPC組),正常供肝移植組(normal donor group,N組).3. 生存率觀察,根據(jù)以上分組分別設(shè)立生存率觀察亞組:(Ss組、SPCs組、Ns組).4. 標本采集:各組大鼠

13、分別于再灌注后24、48、72h處死,取材檢測.5. 生化學檢測:大鼠血清生化檢測.6.肝組織谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、髓過氧化物酶(MPO)檢測.7.肝臟病理組織檢查:光學顯微鏡及電子顯微鏡下觀察組織學變化.8.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端生物素標記法(TUNEL)檢測凋亡.9. 肝臟內(nèi)保護性基因A20 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測10.統(tǒng)計學處理,所有實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)

14、計學處理,P<0.05判定有統(tǒng)計學差異. 結(jié)果: Ss組、SPCs組和Ns組大鼠的7天存活率分別為70﹪、40﹪和90﹪,Kaplan-Meier生存率曲線顯示Ns組大鼠的存活率明顯高于SPCs組(P<0.05),而Ss組與SPCs組比較或于Ns組比較均無顯著差異(P>0.05).受體大鼠ALT、AST和TB等肝功能指標均在移植后72h內(nèi)不斷升高.與其他兩組相比,SPC組肝功能指標處于較高水平.與N組相比,移植后24h,

15、SPC組ALT顯著高(P<0.05);移植后48h,SPC組AST、TB值顯著高(P<0.05);移植后48h,SPC組ALT、AST、TB值顯著高(P<0.05).S組與N組移植后3個時點的肝功能指標未見統(tǒng)計學差異(P<0.05).24h時點SPC組GSH明顯高于N組(P<0.05),S組MDA明顯高于N組(P<0.05),48h時點的SPC組MDA明顯高于N組(P<0.05).24h時點SPC組及N組GSH均明顯高于S組(P<0.0

16、5).S組和SPC組各時點出現(xiàn)嚴重的小梁結(jié)構(gòu)破壞,肝竇擴張,肝細胞腫脹變性,尤以SPC組為重,N組大鼠術(shù)后各時點小梁結(jié)構(gòu)無殊,細胞形態(tài)基本正常.N組大鼠肝臟細胞凋亡少,S組大鼠肝臟可見少量凋亡小體,多于N組.而SPC組大鼠肝臟內(nèi)可見大量凋亡細胞.移植后24h,N組大鼠肝臟內(nèi)即有A20的表達,而S組和SPC組大鼠肝臟內(nèi)無表達;移植后48h,N組大鼠肝臟內(nèi)A20表達強,S組大鼠肝臟內(nèi)A20有表達,而SPC組表達弱;移植后72h,3組大鼠肝臟