17β-雌二醇對小鼠肺成纖維細胞的影響研究.pdf

1、目的：觀察17β-雌二醇（17β-E2）對小鼠肺成纖維細胞內小凹蛋白（Caveolin-1）的表達以及細胞外信號調節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信號轉導途徑的影響改變，是否可以降低Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達，探討17β-E2抗肺纖維化的作用，為進一步的實驗提供理論依據。
　　方法：取液氮下凍存的小鼠成纖維細胞，37℃水浴復蘇1min后接種于含體積分數為10％的血清、體積分數

2、為1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h、3d、5d后，通過倒置相差顯微鏡觀察小鼠成纖維細胞形態(tài)變化；用濃度為20mg/L、50mg/L和100mg/L的SiO2刺激小鼠肺泡巨噬細胞24h，產生的上清液經離心提取后-20℃環(huán)境備用；根據SiO2濃度、17β-E2濃度以及17β-E2的干預時間三因素三水平，運用正交設計分為9組進行MTT增殖實驗，確定17β-E2最佳的作用濃度和時間；依據正交設計的結果

3、將細胞進行分成5組進行處理，即空白對照組、SiO2組、SiO2+10-8mol/L濃度的17β-E2組（低濃度17β-E2干預組）、SiO2+10-7mol/L濃度的17β-E2組（中濃度17β-E2干預組）和SiO2+10-6mol/L濃度的17β-E2組（高濃度17β-E2干預組）；每組細胞處理后依次運用 MTT法測定細胞增殖，流式細胞術測定細胞周期和細胞凋亡，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內鈣離子濃度變化和免疫組織化學法測量細胞內 Ca

4、veolin-1、ERK、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達情況。
　　結果：1、形態(tài)學變化：取剛復蘇的小鼠成纖維細胞放置于倒置相差顯微鏡下，以倍數為10×10鏡下觀察發(fā)現，細胞多呈圓球形且高度折光，懸浮在培養(yǎng)液中。細胞約24h后開始貼壁，細胞多呈梭狀，偶見三角形或多角形，約3d左右細胞可布滿培養(yǎng)瓶70%到80%的面積，約5d左右可鋪滿整個培養(yǎng)瓶瓶壁，折光度明顯降低，呈“鋪路石”般的致密狀，適時可以進行傳代培養(yǎng)。2、正交設計：正交設計的方差分析

5、，結果顯示：不同濃度的SiO2、17β-E2以及17β-E2的干預時間均對細胞增殖預實驗影響差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；進一步對正交設計結果進行極差分析，其結果顯示：對MTT細胞增殖實驗的影響最大的是因素SiO2濃度，其次為17β-E2濃度，最低為17β-E2的干預時間，最佳配對因素SiO2、17β-E2的濃度和17β-E2干預時間分別為20mg/L、10-6mol/L和24h。3、細胞增殖：與空白組對照組比較，在加入 SiO2刺

6、激得來的上清液后，SiO2組的細胞吸光度值明顯升高（P<0.05）；加入干預劑17β-E2后，干預組的吸光度值較 SiO2組明顯降低，且隨著干預劑17β-E2濃度的增加，吸光度值越加降低（P<0.05）。4、細胞周期：與空白對照組比較，在加入 SiO2刺激得來的上清液后，SiO2組 G2和S期的細胞比例明顯增加，G1期的細胞比例明顯減少（P<0.05）；使用干預劑17β-E2后，干預組G2和S期的細胞比例較 SiO2組明顯減少，G1期的

7、細胞比例明顯增多（P<0.05）；且隨著17β-E2的濃度升高，G1期的細胞比例明顯增多，G2和S期的細胞比例明顯減少（P<0.05）。5、細胞凋亡：與正常對照組的細胞比較，SiO2組的小鼠肺成纖維細胞凋亡率顯著降低（P<0.05）；在加入17β-E2后，與 SiO2組進行比較，處于凋亡晚期的細胞比例增多（P<0.05），并隨著雌二醇濃度的升高，凋亡細胞比例的增高越加明顯（P<0.05）。6、免疫組織化學法：與空白對照組比較，SiO2組

8、細胞內的ERK、Ⅰ和Ⅲ膠原表達大量增加（P<0.05），在加入干預劑17β-E2后，與 SiO2組進行比較，干預組細胞內的小凹蛋白表達增加，而 ERK、Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達在減少（P<0.05）；且隨著雌二醇濃度的增高，小凹蛋白的表達增加越明顯，ERK、Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達減少的也越明顯（P<0.05）。7、激光光共聚焦：與空白對照組比較，SiO2組內細胞的熒光強度增高，呈強熒光的狀態(tài)（P<0.05）。加入干預劑17β-E2后，干預組內細胞

9、的熒光強度較 SiO2組明顯減弱（P<0.05）；隨著17β-E2濃度的增高，與 SiO2組比較，其細胞的熒光強度明顯越弱，呈弱熒光表達（P<0.05），但與空白對照組比較仍然高出（P<0.05）。
　　結論：1、17β-E2能通過阻滯小鼠肺成纖維細胞由G1期進入S期和G2期來抑制SiO2引起的細胞增殖，誘導其凋亡。2、17β-E2可誘導小凹蛋白表達，并抑制成纖維細胞內ERK蛋白、Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達。3、17β-E2能抑制SiO2